超实用干货—用嘌呤霉素筛个稳转细胞株

嘌呤霉素(Puromycin)是一种由白黑链霉菌产生的氨基苷类抗生素，是氨酰-tRNA分子3´末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中，打乱核糖体上的肽转运，造成翻译过程中不成熟链终止，从而抑制蛋白质合成。

图1嘌呤霉素结构式(CAS NO. 53-79-2)

嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)，赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。嘌呤霉素作用迅速，在低浓度下即可快速导致细胞死亡。贴壁哺乳细胞对浓度为2-5 µg/ml的嘌呤霉素较为敏感，而悬浮细胞对浓度低至0.5-2 µg/mL的嘌呤霉素已经很敏感。对嘌呤霉素稳定耐药的哺乳细胞可在一周内生成。

稳转细胞株筛选

实验原理：

通过将外源DNA/shRNA克隆到带有pac基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用嘌呤霉素进行筛选。

准备及预实验：

1. 建议使用浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要预实验来确定。

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125 μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节。

2. 溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，0.22 μm滤膜过滤除菌后分装，于-20℃冻存。

3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关，确定杀死未转染细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。初次做实验一定要先进行Puromycin梯度筛选预实验，建立杀死曲线（kill curve）。

1）以5~8×104 cells/孔的密度24孔板铺板，培养过夜。

2）准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15 μg/mL，至少5个梯度）。

3）更换新鲜配制的筛选培养基，继续培养，并观察细胞生长情况，每2-3天更换新鲜筛选培养基。

4）每日观察细胞存活情况，4-6天内有效杀死所有非转染细胞的药物为最低浓度。

稳转株的筛选

慢病毒感染48-72h后（70-80%融合度），将细胞培养于含适当浓度Puromycin的培养液中，筛选至少48h。当对照未转染的细胞加puro组全部死亡时，感染病毒组剩下全部是阳性细胞。

【注】：①当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。细胞密度最好不超过25%。②每日观察细胞生长状态，嘌呤霉素的筛选至少需要48 h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。③病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，越高MOI，含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度，调整嘌呤霉素的浓度去筛选转染细胞，但是嘌呤霉素的浓度不能低于杀死曲线的最低有效浓度；

2）加入含有最低浓度的Puromycin培养基扩增细胞，待qPCR检测结果合格后进行冻存。

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