题目：NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma
stem-like cells
期刊：Cancer Research（IF=9.13）
合作技术：细胞系培养和鉴定
研究背景
神经胶质瘤是成人最常见、最难治疗的原发性脑肿瘤，其肿瘤的发生发展与胶质瘤干细胞（GSCs）相关，因此针对这种细胞亚群的研究有利于胶质瘤的临床治疗。鉴于GSCs位于特殊的微环境中，且其诱导和维持机制在很大程度上仍然是未知的，所以揭示促使GSCs迁移侵袭和自我更新的分子机制对于GSCs定向治疗的发展具有重要意义。在本篇文献中，作者深入研究活化T细胞-1的钙反应转录因子（NFAT1）在GSCs中的作用，并报告了一种新的GSCs维持途径，即NFAT1- NDEL1轴（NDEL1是NFAT1下游靶点，神经发育蛋白1）将成为神经胶质瘤治疗策略的重要目标。
研究内容及结果
1. 神经胶质瘤的临床病理特征与NFAT1表达量有关
在前期胶质母细胞瘤中NFAT1系列研究基础上，作者根据TCGA（癌症和肿瘤基因图谱）和Gravendeel（公开的临床数据集）统计发现，神经胶质瘤的间充质亚型中NFAT1表达水平高于其他几种亚型（图1A），且NFAT1表达不仅与干细胞基因（CD44/Vimentin）和间质转化相关基因（REL/LYN/TGFBR2）表达显著相关，也与胶质瘤的预后较缓相关（图1B-1C）。接下来，从新鲜的临床多形性胶质母细胞瘤（GBM）等样本中分离出GSCs，进行细胞系鉴定和富集培养，通过RT-qRCR和免疫荧光染色实验发现，NFAT1高表达与胶质瘤的恶性亚型和GSCs的生长侵袭有关（图1D-1E）。
图1 NFAT1表达与神经胶质瘤的临床病理特征的关系
2. NFAT1影响GSCs的生长和侵袭
为确定NFAT1对GSCs的生理影响，一方面，采用两个独立的shRNAs分别去转导高表达NFAT1的LN229和G10 GSCs细胞。WB结果证实，其中一个NFAT1 shRNAs (shNFAT1-2) 转导LN229和G10 GSCs后NFAT1减少了80%以上（图2A）；体外细胞活性测定和流式分析显示，NFAT1沉默显著地降低GSCs的活性并诱导细胞凋亡（图2B-2C）；此外，通过伤口愈合分析、Transwell分析和三维球体侵入分析得到，shNFAT1-2感染GSCs后细胞迁移和侵入行为显著减少，且GSCs球体形成能力下降（图2D-2G）。
另一方面，在基础水平较低的T98G和G03 GSCs中实现NFAT1过表达（图3A）。通过一系列细胞生物学检测得到，NFAT1过表达显著地增强细胞活性并抑制凋亡（图3B-3C）、增加了GSCs的迁移和入侵（图3D-3F）；同时电镜图显示NFAT1刺激GSCs的神经球的形成过程（图4G）。
图2 NFAT1的沉默抑制GSCs的生长和侵袭
图3 NFAT1的过表达促进GSCs的生长和侵袭
3. NFAT1对体内GSCs肿瘤生长具有重要意义
采用颅内小鼠模型，探究NFAT1沉默和过表达对体内GSCs肿瘤生长的影响。大脑切片染色结果显示，与对照shRNA相比，NFAT1的敲除组显著地抑制颅内肿瘤生长（图4A-4B）；Kaplan–Meier生存曲线显示T98G和G03 GSCs的细胞生存率增加，进而可推测出NFAT1 shRNAs（shNFAT1-1和shNFAT1-2）将更有效地延长小鼠生存期（图4C-4F）。综上所述，NFAT1在体外和体内都促进GSCs的肿瘤发生。
图4 NFAT1表达影响体内GSCs的生长
4. NDEL1鉴定为NFAT1下游靶基因
通过开展转录组测序来确定NFAT1的潜在下游靶点，从热图数据中分别初筛出50个NFAT1沉默后下调基因和NFAT1过表达后上调的基因，上述均有可能是NFAT1介导的肿瘤促进基因（图5A-5B）；结合TCGA和Gravendel数据集的生物信息学分析，发现NDEL1表达量在复发性GBMs中显著地上调且涉及到间质过渡和干度增加的生理过程（图5C-5D），同时也发现间充质GSCs细胞的NDEL1表达水平明显高于原神经性GSCs细胞（图5E-5F）。与此同时，在挖掘REMBRANDT补充数据集后发现，NDEL1表达不仅与GBMs低存活率相关，还参与胶质瘤的恶性进展。
图5 神经胶质瘤表达与临床病理特征的关联
5. NDEL1由NFAT1转录调节并参与GSCs的发生发展
通过蛋白质印迹分析初步验证转录组的数据，NFAT1的沉默显著地降低了NDEL1的表达，且NFAT1的过表达显著地增加了NDEL1的表达（图6A-6B）；双标记免疫荧光染色测定出在G10 GSC中NFAT1对NDEL1具有调节作用（图6C-6D）；采用荧光素酶分析法检测NAFT1对NDEL1启动子活性的影响，结合ChIP-qPCR芯片分析得出NFAT与NDEL1启动子结合（图6E-6G）。鉴于NDEL1在GSCs生长和入侵中的作用机制尚未确定，由此使用两个独立的shRNAs来稳定地沉默G10 GSCs的NDEL1（图6H）；陆续通过WB检测、流式分析、基质凝胶分析、三维球体侵入分析得到，NDEL1的沉默显著降低了G10 GSCs的侵入能力，且在很大程度上抑制了G10 GSCs的自我更新能力（图6I-6M）。
图6 NDEL1由NFAT1的转录调节
6. 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表达可部分恢复肿瘤生长和侵袭
为了进一步研究NFAT1是否通过调节NDEL1表达来部分支持GSCs的攻击行为，作者在FAT1沉默的G10 GSCs中建立NDEL1重新表达的体系（图7A），发现NDEL1重新表达可部分恢复GSCs的生理活性，并减少了NFAT1沉默诱导的细胞凋亡（图7B-7C）。根据基质凝胶分析、三维球体侵入分析和神经球形成检测，得到NFAT1敲除后抑制的GSCs侵袭作用被NDEL1重新表达所挽救（图7D-7E）并恢复了自我更新能力（图7F-7G）；此外，大脑切片染色等体内验证实验表明，通过NDEL1重新表达仅部分非完全地缓解NFAT1基因敲除后体内肿瘤生长的抑制效应，也很可能涉及更多的未知途径。
图7 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表达可恢复体外和体内的肿瘤生长
文章小结
本文旨在探讨NFAT1在神经胶质瘤中的调节机制，通过基因敲除和过表达进行初步验证，发现NFAT1表达与胶质瘤的侵袭性表型和生存率相关；RNA测序显示NFAT1的缺失与NDEL1表达关联；结合挽救实验说明NFAT1调控了NDEL1的启动子活性，NFAT1-NDEL1信号上调后激活ERK去提高GSCs干细胞标志物的蛋白水平和细胞分化水平。综上所述，NFAT1通过调节NDEL1去部分控制GSCs的生长和侵袭，以NFAT1-NDEL1轴为靶点可为胶质瘤患者提供较大可能的治疗机会。
解析文献
Jiang Y, Song YF, Wang R, et al. NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma stem-like cells. Cancer Res. 2019 Apr 2，DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3297.