细胞分离，传代以及合适的酶类选择

研究中我们常常会用到现成的细胞系/株，一般只需要进行细胞传代和保种。然而，这些细胞系常常由于长期体外培养，而丢失原有生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。因此，也有越来越多的人选择原代细胞。

原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。组织主要指：组织器官、外周血及胚胎等。由于原代细胞生长缓慢，繁殖一定的代数停止生长（一般10代以内）。

细胞系第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自于原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系），随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。

细胞株如果通过克隆或其他方法从培养物中阳性筛选出了细胞系的亚群，则该细胞系成 为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株通常会获得一些其他的遗传学改变。

原代细胞与细胞系的区别如下

一．这里我们先介绍原代细胞的分离与培养，再介绍现成细胞系/株的传代和培养。

原代细胞分离培养的思路是取材--分离--培养--鉴定。首先将组织从机体中取出，经胰蛋白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。在原代细胞分离培养的过程中用得比较多的酶类是胶原酶。

胶原酶（Collagenase）是一种蛋白酶，能够特异性地识别Pro-X-Gly-Pro序列并切割该序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之间的肽键。胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。

并且针对不同的组织解离可选用不同的胶原酶类型。目前商业化提供的细菌胶原酶主要根据胶原酶活性的差异，分为不同类型：包括胶原酶I型、II型和IV型，可作用于不同类型的组织解离。

胶原酶I（Type I Collagenase）：含有比较均匀的各种酶活力（包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性）。通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。

胶原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心脏、骨、肌肉、胸腺和软骨等组织来源细胞的制备；

胶原酶III（Type III Collagenase）：含有较低的蛋白酶活性，常用于乳腺细胞的制备；

胶原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰岛细胞的制备，或者需要维持受体完整性的细胞制备实验。

胶原酶V（Type V Collagenase）：具有更高的胶原酶活性和酪蛋白酶活性，更低的胰酶水平以降低对细胞膜蛋白的损伤，适用于胰腺小岛细胞和结缔组织细胞的分离。

二．研究如果用到现成的细胞系或者细胞株。传代可以如下操作：

收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张)，排除细胞本身污染的情况。

①先确定细胞传代的时间：

一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。

②确定传代细胞类型：

1. 贴壁细胞的传代：

去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min;弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶补足培养基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。

2.悬浮细胞传代：

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加完全培养液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。

3.贴壁细胞传代胰酶的使用方法和消化时间

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

除了以上常用的胰酶和胶原酶。还有一些常用的替代产品。比如Accutase是包含蛋白水解酶和胶原酶活性的一种细胞消化液，是胰酶/EDTA消化液的完美替换产品。用于从常规组织培养器皿和粘附培养器皿中消化细胞。适用于组织解离和细胞分离，因分离后的细胞能保持完好的表面抗原，且不含任何动物动物或者细菌来源组分，可满足对后续如细胞表面标记、病毒生长分析、流式细胞分析以及生物反应器相关检测等多种实验的要求。

还有Dispase II，中文名分散酶II，一种非特异性金属蛋白酶，细胞生物学中常用于从不同的组织或器官分离单细胞，并用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。另外，Dispase II还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。与其他细胞生物学常用蛋白酶（如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等）相比，该酶具有以下优势：1）一种快速有效且温和的细胞消化酶，对细胞损伤小，且能维持细胞膜完整性；2）来源于细菌，无支原体或其他动物病毒污染；3）稳定性强，不受温度、pH及血清组分的影响；4）可用于多种类型组织和细胞的分离等。

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