还记得小编之前给大家发送过的你绝对不能错过的RNA提取小技巧吗?那个时候可是受到读者的一致好评呢,因此今天开始小编又要来发干货啦!今天的主题主要围绕以下两个问题进行:
别的不多说了,直接进入主题~1.RNA抽提原理、实验过程简介、试剂盒介绍。2. 不同样本RNA抽提方案推荐。
1.先来说一说RNA提取的基本原则,主要是以下三点:
2.再来讲讲RNA提取的本质,主要就是以下三点:(1)保证RNA的完整性。(2)获得高纯度的RNA。(3)操作简便,稳定性强。
3.总RNA提取的方法(1)裂解:破碎细胞膜。(2)纯化:除蛋白、多糖多酚、次生代谢产物、脂质。(3)回收RNA。
4.过柱吸附法原理Total RNA的提取方法根据原理的不同主要分为2类:过柱吸附法和沉淀法。
以离心吸附柱分离为原理,柱子上的基质结合RNA的方式取决于缓冲液体系的盐离子浓度和PH值,通常只有RNA能绑定到柱子上,而蛋白质将被洗到下游液相或保留在柱子的顶部,然后用所提供的洗液洗净结合在柱子上的RNA,以消除残留的杂质,最后用洗脱液洗脱总RNA。
5.沉淀法原理:样本裂解后通过氯仿抽提去除杂质,用异丙醇沉淀的方式回收RNA.
6.RNA抽提方法介绍(试剂盒)
7.不同样本方案推荐(1).LC Sciences Cat. TRK-1001(2).LC Sciences Cat. TRK-1002(3).Rneasy Mini Kit-217004(4).Fatty Tissue RNA Purification Kit -36200(5).FFPE RNA Purification Kit-25300(6).Plasma/Serum/ Circulating /ExosomalRNA Purification Kit-51000(7).Urine Total RNA Purification Maxi Kit -29600(8).Preserved Blood RNA Purification Kit II Product Insert -43500(for use with PAXgene Blood RNA Tubes)(9).Trizol Reagent(10).酸酚法+TRK-1002(11).Trizol+QIAGEN217004(12).trizolLS+TRK-1002(13).Trizol+TRK-1002(14).RNAprep Pure Plant Kit-天根DP441注意:LCB提供的所有RNA抽提方案均进行DNA消化处理。
Tips:
β-巯基乙醇:是一种还原剂在 RNA 提取中的主要作用是变性核糖核酸酶,巯基乙醇是用在一些 RNA 分离过程,以消除在细胞裂解释放的核糖核酸酶。大量的二硫键使得核糖核酸酶非常稳定,所以使用巯基乙醇,以减少这些二硫键和不可逆转的变性蛋白质。这使得在 RNA 提取过程中,放置核糖核酸酶对 RNA 的降解。
蛋白酶 k :是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,用于生物样品中蛋白质的一般降解。它是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。蛋白酶 K 的一般工作浓度是50-100μg/ml。在较广的 pH 范围内(pH 4-12.5)均有活性
DNase I:Deoxyribonuclease I(脱氧核糖核酸酶 I)是一种可以消化单链或双链 DNA 产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
Glycogen :糖原,用于 RNA 样品的快速沉淀,具体为在加了保存液的 RNA 样品中加入 2.5ul Glycogen, 混匀,于-80℃直立放置 30min,若不加 Glycogen ,则需要-20℃静置过夜沉淀。
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