Metabolism（IF=13.934）｜杨吉春/迟毓婧团队揭示FAM3A-FOXD3轴是代谢性疾病的可行干预靶点
线粒体功能障碍在糖尿病等代谢性疾病的发病机制中起着至关重要的作用，主要表现有ATP合成减少和ROS产生增加，这与ATP合酶(ATPS)在疾病发生时组装及活性下降有关。FAM3A蛋白是序列相似家族3成员之一，主要位于肝细胞、胰腺β细胞、脂肪细胞和血管平滑肌细胞的线粒体中，研究报道FAM3A的激活可以逆转肥胖糖尿病小鼠的高血糖和脂肪变性，并通过改善线粒体功能障碍保护各种细胞类型免受氧化诱导的死亡，这些调控作用均与FAM3A可促进ATP的产生与释放相关。然而，FAM3A诱导线粒体ATP产生的机制目前尚不清楚。 北京大学医学部基础医学院杨吉春教授与北京大学人民医院迟毓婧副研究员团队，在Metabolism（IF=13.934）期刊发表题为“FAM3A maintains metabolic homeostasis by interacting with F1-ATP synthase to regulate the activity and assembly of ATP Synthase”的研究论文。文章表明FAM3A通过激活FOXD3调节ATPS的活性和组装，进一步促进ATP的合成并抑制ROS的产生，揭示激活FAM3A-FOXD3信号轴是一种恢复ATPS组装以治疗代谢紊乱的可行策略。
文中Human FAM3A/ATP5A1/ATP5B/ATP5G1 过表达质粒，FOXD3干扰腺相关病毒由维真生物荣幸提供！ 病毒产品 AAV8-U6-shFOXD3 AAV8-U6-GFP （pAV-3in1-shRNA-GFP ） 注射动物 8周龄 C57BL/6J 雄性小鼠 注射方式 尾静脉注射 病毒用量 5×10E11 vg
研究方法与结果
1、FAM3A与F1-ATPS相互作用激活ATPS
实验数据表明，FAM3A蛋白主要位于小鼠和人肝细胞线粒体基质中，作者在HepG2细胞中过表达FAM3A，以确定与之互作的蛋白，Co-IP质谱分析与GST下拉实验表明FAM3A与位于线粒体基质中形成F1-ATPS的ATPSβ和ATPSα存在直接相互作用。当FAM3A发生突变后，仍能与ATPS结合但不能增加细胞内ATP含量并诱导Akt磷酸化，而在FAM3A过表达的肝细胞中则伴随FAM3A-ATPS相互作用增强，ATP含量增加，ROS和MMP（线粒体膜电位）生成减少。表明FAM3A是一种新型的ATPS活性成分，它通过与F1-ATPS相互作用激活ATPS活性，增加ATP的产生，减少MMP和ROS的产生。
图1. FAM3A蛋白定位于线粒体基质，与ATPS相互作用调节其活性
2、FAM3A通过激活CREB-FOXD3轴调控ATPSβ的表达
先前的研究报道，在肥胖糖尿病小鼠肝脏中FAM3A和ATPSβ的mRNA和蛋白水平同步变化，提示FAM3A除了调节其蛋白活性外，还可能调节ATPSβ基因的转录。生物信息学预测结果显示，人、小鼠和大鼠的ATPSβ基因启动子都具有转录因子FOXD3（叉头盒D3）的结合位点，而FOXD3和ATPSβ的mRNA和蛋白水平均受FAM3A的表达影响，进一步评估发现FOXD3通过与ATPSβ启动子结合直接调节ATPSβ的表达。小鼠肝细胞中FAM3A和FOXD3的过表达上调了ATPSβ和其他ATPS关键亚基以及多个ATPS组装因子的mRNA水平，此外，FAM3A和FOXD3的过表达还增加了小鼠和人肝细胞ATPS活性。
图2. FAM3A过表达激活了肝细胞FOXD3和ATPSβ的表达
生物信息学预测显示，人和小鼠FOXD3基因启动子上含有转录因子CREB(cAMP反应元件结合蛋白)的潜在结合位点，文献报道CREB在各种细胞类型中都可以被Akt磷酸化和激活。ChIP和荧光素酶报告分析验证CREB结合并激活人FOXD3基因的启动子活性，CREB过表达可增加HepG2细胞中FOXD3和ATP β的mRNA和蛋白水平以及ATP含量，CREB沉默则得到了与之相反的结果。进一步验证，FAM3A可诱导Akt和CREB的磷酸化以及FOXD3和ATPSβ的上调，这一过程可被ATP受体抑制剂suramin逆转。上述结果表明，FAM3A通过激活ATP-Akt-CREB通路刺激FOXD3表达，进而诱导F1Fo-ATPS基因和组装基因转录，提高ATPS活性。
图3. FAM3A激活CREB上调FOXD3和ATPβ在肝细胞中的表达
3、肝脏FOXD3过表达可以改善HFD小鼠的糖脂紊乱
在肥胖小鼠肝脏中过表达FOXD3后，ATP含量和ATPS能力显著增加，小鼠葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗得到明显改善，糖异生和脂肪生成基因的表达水平也有所降低。此外，FOXD3过表达增加了小鼠肝脏中CREB的磷酸化，同时伴随着Akt的激活。进一步过表达ATPSβ进行验证，发现Akt和CREB磷酸化增加，小鼠肝细胞中FOXD3和ATPS组装基因表达上调。这些发现揭示了肝细胞中ATP、Akt、CREB、FOXD3和ATPS之间可能存在一个新的调控环路。
图4. 肝脏过表达FOXD3可以改善HFD小鼠的糖脂紊乱
4、抑制肝脏FOXD3的表达损害了ATPS的组装，加重了小鼠的糖脂紊乱
另一方面，作者通过尾静脉注射AAV-shFOXD3（或AAV-GFP）抑制肝脏FOXD3的表达，然后进行HFD或ND饲喂，HFD喂食10周后，AAV-shFOXD3组小鼠比AAV-GFP对照组小鼠表现出更严重的葡萄糖耐受不良，此外，AAV-shFOXD3组小鼠的空腹血糖、糖异生和胰岛素抵抗也有所加重，MRI和形态学分析显示FOXD3的沉默增加了HFD小鼠肝脏脂肪沉积和整体脂肪量。定量分析显示，AAV-shFOXD3小鼠肝脏中TG（甘油三酯）和CHO（总胆固醇）水平升高，此外FOXD3的沉默降低了小鼠肝脏中的ATP含量、ATPS能力以及FOXD3、ATPS关键亚基和组装因子的表达水平，抑制了Akt、FOXO1和CREB的磷酸化水平，同时提高了糖异生蛋白和脂肪生成蛋白水平。
图5. 抑制肝脏FOXD3的表达损害了ATPS的组装，加重了小鼠的糖脂紊乱
最后，作者构建了肝脏特异性FOXD3敲除小鼠(FOXD3hep−/−)，与FOXD3fl/fl对照小鼠相比， FOXD3hep−/− 小鼠在喂食HFD后表现为肝脏糖异生增加，胰岛素抵抗，葡萄糖耐受不良加重和空腹高血糖，同时肝脏脂肪沉积和整体脂肪量增加，定量分析表明，FOXD3hep−/−小鼠肝脏和血清中TG水平均显著升高，血清中CHO水平升高。此外，肝脏中FOXD3敲除降低了ATPS能力、ATP含量和ATPS关键亚基mRNA水平，增加了小鼠肝脏中糖异生蛋白和脂肪生成蛋白水平，进一步说明肝脏FOXD3的表达受损会破坏ATPS的组装，加重小鼠的糖脂紊乱。
图6. 肝脏特异性敲除FOXD3损害了ATP组装，加重了小鼠的糖脂紊乱
结论
该研究确定了线粒体蛋白FAM3A是一种新型的ATPS活性成分，FAM3A与F1-ATPS相互作用，首先增加ATP的产生和释放，释放的ATP通过激活FOXD3增强ATPS的能力，促进FAM3A对ATP产生和ROS抑制的作用。研究结果为FAM3A在ATPS活性和组装中的作用提供了理论基础，同时为糖尿病和肥胖等代谢性疾病的治疗提供了一种可行策略。
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