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circRNA研究如雨后春笋，全流程解决方案助力临床及产业化

作者：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 2024-09-29T00:00 (访问量:6105)

作为近几年兴起的突破性技术，mRNA技术通过脂质纳米颗粒（ LNP ）将mRNA导入体内来表达抗原蛋白，以刺激机体产生特异性免疫反应。新冠肺炎疫情（ COVID-19 ）爆发后，针对性的mRNA疫苗在多种疫苗类型中脱颖而出。与此同时，环状RNA（ circRNA ）以其高度稳定的结构，不需要修饰核苷酸和加帽加尾修饰等优势，逐渐走入大众视野，并迅速引发资本市场和业内研究人员的高度关注。

circRNA 技术路线：

1 模板制备

在该环节中，高质量的质粒制备尤为重要，关系到后续体外转录产物的质量。环状质粒由于无有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物。为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒需确保双链为平末端或5’端为突出结构。此外，为了使转录产物中不带有酶切位点残基序列，通常质粒线性化时需要使用IIS型限制性内切酶进行质粒酶切。近岸蛋白提供GMP级生产BsaI（Cat#GMP-RE026）、BspQI（Cat#GMP-RE057）和XbaI（Cat#GMP-RE015）限制性内切酶，高效线性化质粒。

1.1 Bsa I，GMP Grade，Cat#GMP-RE026

限制性内切酶Bsa I 特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，制备mRNA体外合成模板；

酶切位点：

产品特点：

强特异性；
受CpG、Dcm甲基化影响，剪切阻断；
受EcoBI甲基化影响，剪切可能受影响；
不受Dam甲基化影响。

50μl 酶切体系内，1U BsaI 引入量前提下，调整质粒加量进行酶切，结果显示 BsaI 可完全酶切 10μg 质粒。受质粒类型及超螺旋比例等因素影响，酶切效率有较大差异，需根据实际情况调整酶切体系。

1.2 BspQI, GMP Grade，Cat#GMP-RE057

限制性内切酶BspQI特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，制备mRNA体外合成模板；

酶切位点：

产品特点：

对Dam、Dcm和哺乳动物CpG甲基化不敏感。
BspQI的同裂酶有LguI、PciSI、SapI。

1.3 XbaI, GMP Grade，Cat#GMP-RE015

限制性内切酶XbaI特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，制备mRNA体外合成模板；

酶切位点：

2 RNA 体外转录

此步以DNA为模板，在体外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

2.1 T7 RNA Polymerase, GMP Grade，Cat#GMP-E121，Cat#GMP-E122

作为生物大分子，mRNA可通过体外转录（IVT，in vitro transcription）的方法大规模合成，T7启动子是目前转录效率最高的启动子之一，因此采用T7 RNA Polymerase进行体外转录可简单快速获得大量的RNA分子。T7 RNA Polymerase是体外转录生产治疗用mRNA的关键酶。

dsRNA作为体外转录的副产物之一，能够被对应的核酸受体识别，引发天然免疫炎症反应，严重影响mRNA疫苗的效果，在生产过程中需要严格控制。经分子进化改造获得的T7 RNA聚合酶突变体（目录号：GMP-E122）可明显降低转录产物中dsRNA的含量。

产品特点：

有效降低dsRNA含量
产量高，150-250μg/20μl反应体系
共转录体系加帽率高
可转录不同长度片段，产物完整性好

2.2 RNase inhibitor, GMP Grade，Cat#GMP-E125

RNase Inhibitor可与RNase A形成1：1复合体，对RNase 有极强非竞争性抑制，保护mRNA转录后不被降解

产品特点：

强抑制RNase活性；

稳定性强，适合更高转录温度体系探索。

2.3 Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade，Cat#GMP-M036

RNA体外合成过程中加入无机焦磷酸酶，增加RNA产量。

Pyrophosphatase, Inorganic可催化无机焦磷酸盐水解生成P2O74-+H2O+PPase→2HPO42-，一方面可去除无机焦磷酸盐对反应体系的抑制，另一方面为反应提供热力学动力，促进产物的生成，在mRNA疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。

2.4 核苷酸，Cat#GMP-S033-036D

核苷三磷酸（ NTP ）可用于分子生物学中多种相关应用；

3 模板去除（DNaseI, GMP Grade，Cat#GMP-E127）

此步为RNA转录结束后，双链DNA模板去除

4 RNA环化

环化工艺有三种不同的制备方法，不同的方式、不同的RNA长度都可能带来不同的环化效率。以I型内含子为基础，搭配有助于剪接的辅助序列，可实现环化1500nt以上的RNA。II型内含子剪接有酵母菌或破伤风杆菌来源，Ⅱ型内含子的自催化剪接反应可以在体外人工制备环状RNA，利用Ⅱ型内含子的六个结构区域中的（D1-D3）以及（D5-D6）序列倒转，可以形成自剪接活性的核酶，此种方法制备的环状RNA没有外来序列的残留。通过酶法环化可以避免外源序列引入导致的免疫原性，同时发展了借助内源性的夹板链实现RNA的环化。

近岸蛋白提供GMP级T4 RNA Ligase 2（Cat#GMP-M050），助力circRNA药物开发及申报。

5 circRNA 纯化

环化结束后，需要通过系列纯化手段对circRNA进行高纯度回收，由于不同环化方式的效率差异，RNase R的引入，有效去除未环化的线性RNA，从而达到纯化circRNA的目的。RNase R几乎能够消化所有线性的RNA，但不易消化环状RNA、套索结构RNA和3'端突出少于7个核苷酸的短双链RNA分子。近岸蛋白经过系列验证，重磅推出高活性RNase R（Cat#GMP-E224）。