由细菌性病原体结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病(TB)是一个主要的全球卫生问题，每年造成150万人死亡。当病原体进入肺部时，细菌和宿主间产生的相互作用会诱导组织重塑，产生慢性炎症病变，即肉芽肿。肉芽肿是结核病的病理标志，然而它们的功能和形成机制仍然知之甚少。哈佛大学公共卫生学院免疫与传染病学系Eric J. Rubin教授团队，以“Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomas is spatially organized”为题在线发表于Nature Medicine（IF 87.241）。该研究团队通过以空间蛋白质组学、空间代谢组学为核心的空间多组学技术，揭示了在肉芽肿形成过程中，其炎症信号的空间定位信息及结核病疾病发生机理，为结核病临床研究提供了理论依据。
研究材料
人结核肉芽肿组织、兔结核肉芽肿组织
技术路线
步骤1：建立人类肉芽肿中蛋白质表达空间解析图；
步骤2：筛选不同肉芽肿样本中的差异蛋白；
步骤3：空间代谢组学检测肉芽肿；
步骤4：探究肉芽肿病灶区促炎反应；
步骤5：探究肉芽肿周围活性组织的抗炎症反应。
研究结果
1. 建立人类肉芽肿中蛋白质表达空间解析图
研究材料
人结核肉芽肿组织、兔结核肉芽肿组织
技术路线
步骤1：建立人类肉芽肿中蛋白质表达空间解析图；
步骤2：筛选不同肉芽肿样本中的差异蛋白；
步骤3：空间代谢组学检测肉芽肿；
步骤4：探究肉芽肿病灶区促炎反应；
步骤5：探究肉芽肿周围活性组织的抗炎症反应。
研究结果
1. 建立人类肉芽肿中蛋白质表达空间解析图
作者使用来自多个个体的肺样本以及来自同一肺不同分化阶段的肉芽肿，根据组织学将这些病变分为固体肉芽肿、干酪样肉芽肿和空洞性肉芽肿，并通过空间蛋白质组学进行分析。首先使用激光显微切割技术（LCM）分别提取出实性肉芽肿活性组织，干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的活性组织，以及干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的坏死组织，然后采用Label free方法对这5种样本的蛋白质组进行分析，共鉴定到4406个蛋白，并以此建立了人类肉芽肿中蛋白质表达的空间解析图。
图1 空间蛋白质组学分析肉芽肿蛋白表达图谱
图1 空间蛋白质组学分析肉芽肿蛋白表达图谱 2. 筛选不同肉芽肿样本中的差异蛋白
作者通过分析肉芽肿的蛋白质组学数据，发现肉芽肿内部的变异远远多于肉芽肿亚型之间的变异。PCA分析及聚类结果表明，无论肉芽肿切除的病变类型如何，其活性区域都聚集在一起，坏死区域同样如此。接着作者对得到的差异蛋白进行GO和 KEGG富集分析，发现具有显著差异的功能蛋白主要参与炎症和抗微生物过程。值得注意的是，参与产生促炎二十烷类的蛋白质在坏死区域中也更丰富。此外，代谢花生四烯酸（AA）的蛋白质，包括ALOX5, ALOX5AP和LTA4H，在坏死组织区域中显著富集。这些结果表明AA的产物、结核感染期间炎症的关键介质二十烷类可能发挥重要作用。
图2 不同肉芽肿样本中差异蛋白的分布情况
图2 不同肉芽肿样本中差异蛋白的分布情况 3. 空间代谢组学检测肉芽肿AA
4. 探究肉芽肿病灶区促炎反应
图5 TNF-α和LTA4H在坏死组织及其边缘更为丰富
小结
该文章通过空间蛋白质组学、空间代谢组学等研究方法，绘制了人类肉芽肿的空间分子图谱。研究结果表明，肉芽肿中心具有以抗微生物、ROS和二十烷类特征的促炎环境。相反，肉芽肿周围的活性组织具有相对抗炎的特征，且肉芽肿内不同种类的区域之间有独特的分子特征。尽管此结果需要在更大的样本集中得到证实，但本文的研究数据表明，真正的平衡发生在局部，系统性干预可能相当复杂。
作者使用免疫组化（IHC）和共聚焦显微镜来定位多个参与含AA溶血磷脂生产的磷脂酶，发现大多数在整个肉芽肿中弥漫性表达。虽然生物合成酶的存在表明它们的最终产物可能会积累，但酶的丰度和其产物可能并不相关。因此作者使用空间代谢组学技术直接测量AA的丰度，对人类活性、干酪性和空洞性肉芽肿中的AA和AA前体进行了成像，发现它们的丰度模式与空间蛋白质组学分析确定的代谢AA的蛋白质表达一致。结果表明，正常肺组织中很少检测到AA，但整个肉芽肿中都有AA合成，且在坏死组织边缘富集。此外，兔活性组织和坏死组织的空间代谢成像显示了与人类肉芽肿相似的AA分布模式。
图3 空间代谢组学检测肉芽肿中AA丰度
图3 空间代谢组学检测肉芽肿中AA丰度 研究表明AA可以进入促炎或抗炎通路。白三烯A4水解酶(LTA4H)是代谢AA的蛋白质，作为一种促炎二十烷类，其能够促进炎症反应的发生，且与TNF-α的产生有关。蛋白质组学结果表明，LTA4H在坏死组织区域显著富集。IHC结果显示，空洞肉芽肿病变组织和干酪肉芽肿病变组织边缘有较多的LTA4H，而在实性肉芽肿中几乎没有LTA4H。此外，TNF-α在实体肉芽肿中含量相对较低，但在干酪性肉芽肿和空洞样肉芽肿的坏死边缘含量较高。值得注意的是，IHC的结果表明TNF-α与LTA4H具有相似的分布，共定位约为85.3%。同样的结果在兔子的实性和干酪性病变样本中得到了重现。这些结果说明空间LTA4H介导的促炎反应与TNF-α的产生有关。
图4 白三烯生物合成在坏死和直接毗邻坏死组织的细胞层中富集
图4 白三烯生物合成在坏死和直接毗邻坏死组织的细胞层中富集图5 TNF-α和LTA4H在坏死组织及其边缘更为丰富 5. 肉芽肿周围活性组织的抗炎症反应研究
与坏死肉芽肿的中心相反，在肉芽肿周围发现的细胞中含有更多的抗炎蛋白质组学特征，即抗炎调节剂和还原剂在肉芽肿周围富集。在二十烷类通路中，前列腺素合成可缓和结核病变中的炎症。负责前列腺素合成的酶，即环氧化酶1和2 (COX1/2)，在实体肉芽肿中富集，与该肉芽肿整体炎症较轻的特征一致。通过LC-MS靶向代谢组学数据分析前列腺素浓度，发现它们在活性组织中表达更丰富。在空洞性肉芽肿和干酪样肉芽肿中，作者发现COX1和COX2在活性组织层中广泛表达，但在坏死的干酪性区域中基本不表达，这与LTA4H丰度的模式形成对比。此外，虽然LTA4H在巨噬细胞亚群中特异性表达，但作者发现COX1/2在巨噬细胞和成纤维细胞中均有表达。在兔组织中，相比于TNF-α和LTA4H，COX1/2在活性组织区域更丰富，而在坏死的干酪性区域中较少，这与在人类组织中的观察结果相同。因此，各种二十烷类化合物(白三烯)的相对丰度表明，肉芽肿的高度促炎中心被缓和炎症的分子包围，包括COX1/2通路的一些前列腺素，可以缓解炎症。
图6 COX1/2在所有肉芽肿区域广泛表达
图6 COX1/2在所有肉芽肿区域广泛表达小结
该文章通过空间蛋白质组学、空间代谢组学等研究方法，绘制了人类肉芽肿的空间分子图谱。研究结果表明，肉芽肿中心具有以抗微生物、ROS和二十烷类特征的促炎环境。相反，肉芽肿周围的活性组织具有相对抗炎的特征，且肉芽肿内不同种类的区域之间有独特的分子特征。尽管此结果需要在更大的样本集中得到证实，但本文的研究数据表明，真正的平衡发生在局部，系统性干预可能相当复杂。