基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。
实验材料
基因组DNA提取试剂盒； EcoRI酶（或Pst I酶）,MseI酶，T4连接酶试剂盒； Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer； AFLP引物；凝胶电泳所需试剂。
PCR仪，水平电泳和垂直电泳，银染试剂，凝胶成像系统。
银染试剂：
固定液：1%体积比的冰醋酸溶液。
染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加ddH2O定容至1L。
显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸钠，加ddH2O定容至1L。
实验过程
一、基因组DNA提取
用基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组，通过凝胶电泳和分光光度计检测DNA的浓度和纯度。DNA可用纯化试剂盒以提高纯度，方便后续实验进行。实验所需的基因组DNA约100ng左右。
二、酶切处理
1、EcoRI酶切 20μL酶切体系
|
成分 |
体积（ul） |
|
载体DNA |
5 |
|
10X Buffer |
2 |
|
EcoRI |
1 |
|
ddH2O |
补足12ul |
37℃酶切处理2h，65℃灭活处理30min，终止反应。
2、MseI酶切 20ul酶切体系
|
成分 |
体积（ul） |
|
载体DNA（EcoRI酶切产物） |
5 |
|
10X Buffer |
2 |
|
MseI |
1 |
|
ddH2O |
补足12ul |
37℃酶切处理2h，80℃灭活处理30min，终止反应。
3、连接 20ul连接体系
|
成分 |
体积（ul） |
|
目的基因（双酶切产物） |
10 |
|
T4连接酶 |
2 |
|
T4 Buffer |
2 |
|
EcoRI接头 |
1（10倍稀释） |
|
MseI 接头 |
1（不稀释） |
|
ddH2O |
4 |
22℃连接2-3h。
4、预扩增 20ul反应体系
|
成分 |
体积（ul） |
|
连接产物 |
4 |
|
引物（100uM分别稀释14倍） |
1 |
|
ddH2O |
8.8 |
|
MgCl2 |
1.6 |
|
dNTPs（2.5mM） |
1.6 |
|
Tap 酶 |
1 |
|
10 X Buffer |
2 |
预扩增程序
|
Step 1 |
94℃ |
2min |
|
Step 2 |
94℃ |
20s |
|
Step 3 |
56℃ |
30s |
|
Step 4 |
72℃ |
2min |
|
Step 5 |
60℃ |
30min |
|
Step 6 |
4℃ |
保持 |
Step 1预变性以后，step 2-step 4重复20个循环，然后进入step 5延伸。
5、选择性扩增 20ul扩增体系
|
成分 |
体积（ul） |
|
预扩增产物（20倍稀释） |
4 |
|
引物（M引物100uM分别稀释14倍，E引物100uM分别稀释100倍） |
1 |
|
ddH2O |
8.8 |
|
MgCl2 |
1.6 |
|
dNTPs（2.5mM） |
1.6 |
|
Tap 酶 |
1 |
|
10 X Buffer |
2 |
扩增程序
|
Step 1 |
94℃ |
2min |
|
Step 2 |
94℃ |
20s |
|
Step 3 |
66℃ |
30s |
|
Step 4 |
72
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