1.眼部新生血管疾病中VEGF上调与炎症的关系

研究人员通过观察外周血中VEGF和炎性细胞因子的上调，开始认识到血管生成和炎症在眼部新生血管疾病中的潜在双重功能。CNV和RNV患者房水中VEGF和炎性细胞因子的上调，然而，它们之间的关系主要在小型人群中中得到正式检查。因此，作者从大量患者中收集房水样本CNV（n=53；补充表1），RNV（n=52；补充表2）和对照受试者（n=50；补充表3），并使用CBA检测技术来量化VEGF和其他促炎细胞因子（图1a和补充图1a）。如图1b所示，CNV患者的VEGF表达比健康对照组高3倍。CNV患者的主要促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子（TNF），均分别上调3倍，10倍和3倍（图1b）。如报告所述，IL-6炎性细胞因子可诱导VEGF的产生。此外，作者观察到促炎性细胞因子水平与VEGF之间存在强正相关（图1c和补充图2a）；平均黄斑厚度（MMT）与VEGF和促炎细胞因子IL-6和IL-1β相关（图1c和补充图2a）。RNV患者表现出类似的促炎细胞因子上调，并与MMT相关（补充图。1b、c和2b）。这些结果不仅证实了先前关于VEGF和促炎细胞因子在眼部新生血管疾病中异常上调的报道，而且还揭示了VEGF介导的眼部新生血管与炎症之间的关联，其中IL-6和IL-1β可能在这些疾病的发病机制中起重要作用。为了研究眼部新生血管的组织病理学，作者使用了临床前小鼠和非人灵长类CNV模型，该模型由眼底激光光凝诱导（图1d和补充图3）。

作者检测到CNV诱导的小鼠房水中VEGF（约3倍）和促炎细胞因子IL-6（20倍）、IL-1β（3.5倍）和TNF（3.5倍）显著增加（图1e），食蟹猴模型中也有类似的失调（补充图4）。此外，作者分析了CNV诱导的小鼠脉络膜组织中的新生血管病变。激光光凝诱导新生血管形成，内皮素（CD105）表达，但在对照组小鼠中很少有相关变化（图1f）。CD105⁺血管有大量的VEGF生成并富集，被大量F4/80⁺巨噬细胞包围，这表明VEGF上调和浸润的免疫细胞在促进眼部新生血管形成中的协调作用。此外，作者在CNV新生血管病变周围检测到MMP2和MMP9的大量表达；在对照组的小鼠中未观察到相应变化（图1g）。这种MMP的高表达，可能是由浸润的巨噬细胞产生，MMP将重塑细胞外基质，从而促进免疫细胞浸润和血管生成。从CNV患者和临床前动物模型的结果表明，VEGF和炎症之间的协同作用促进了眼部新生血管疾病。

2.可切割的aV与工程化rREX的耦合连接

研究结果表明，针对眼部血管疾病采用靶向VEGF和炎症的的联合治疗策略更加可行。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞是维持免疫耐受和控制炎症的主要的潜在机制。眼内细胞，特别是色素上皮细胞，具有调节特性，可诱导眼内Treg细胞的产生，防止炎症和维持眼免疫赦免。但由于玻璃体腔内注射Treg细胞并通过炎症介导的免疫调节转化为其他T细胞类型，对视力有不良影响，因此这种方法不适用于眼血管疾病的治疗。Treg衍生的外泌体是一类由Treg细胞内源性分泌的脂质双层囊泡（直径为30–150nm），具有良好的生物相容性、低细胞毒性、免疫惰性和特异靶向性。Treg衍生的外泌体表现出良好的稳定性，有可能作为成品用于急性环境，而细胞需要很长时间才能分离和生长。为了产生REX，在标准分化条件下，将原始CD4⁺T细胞极化以诱导Treg细胞7天（补充图5），并使用超速离心法从培养上清中分离外泌体。

作者设计了一种双靶向策略，将aV与cL（Arg-Val-Gly-Leu-Pro）结合到rEXS上，cL可被MMPs切割（补充图6）。通过将N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和6-马来酰亚胺引入连接体的两端来实现共轭，连接体分别与aV中的氨基和rEXS上的巯基反应。结果表明，纳米药物rEXS–cL–aV有望通过aV阻断VEGF活性和rEXS减轻炎症，从而最大限度地发挥协同效应。结果表明，rEXS上的趋化因子受体可通过炎性趋化因子的梯度增强该纳米药物在新生血管病变中的积累，一旦纳米药物接近新生血管病变，MMP的存在可切割连接物并释放aV以达到局部高浓度（图2a）。

透射电子显微镜（TEM）显示rEXS-cL-aV典型的杯状外泌体形态，平均直径约为120nm（图2b）。通过二级免疫抗体金纳米颗粒的结合验证了aV在rEXS表面的成功偶联（图2c），偶联密度可达每rEXS约10个aV分子。进一步支持成功修饰的是，aV信号在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和插入的受激发射耗尽（STED）图像中与rEXS信号高度共域（图2d），rEXS-cl-aV的尺寸略有增大，ζ电位略有降低（与rEXS相比）（图2e）。免疫印迹进一步验证了rEXS-cL-aV上存在外泌体标记物（CD9、CD47、ALIX和TSG101）、趋化因子受体（CCR6）、Treg免疫抑制蛋白（IL-10和CTLA-4）和偶联aV（图2f和Supplementary Fig 7）。这几乎被MMP9抑制剂GM6001完全抑制（图2g）。被释放的aV也显示了类似与VEGF的结合能力，表明aV的偶联和释放循环并不影响其中和能力（图2h）。最后，rEXS-cL-aV显示出了可靠的稳定性，在4°C磷酸盐缓冲盐水（PBS）中储存（图2i和补充图8）或冻干和复溶（图2j）后，没有检测到粒径和ζ电位的变化。这些结果验证了工程化rEXS-cL-aV具有理想稳定性特征可用于疾病的治疗。

3.rEXS-cL-aV在体外对CECs迁移和存活的双重抑制以及对巨噬细胞的促炎分化作用

作者建立了一个Transwell共培养系统来测试rEXS–cL–aV在抑制CNV相关血管生成和炎症中的作用。将原代脉络膜内皮细胞（CEC）培养在顶腔中以模拟血管生成，并将经脂多糖（LPS）预处理以极化为促炎1型巨噬细胞（M1）的原代巨噬细胞接种在下腔中以模拟炎症微环境。对CEC迁移的评估表明，与PBS或nEXS相比，rEXS、aV或rEXS–fL–aV处理的CEC迁移减少，而rEXS–cL–aV处理的CEC迁移受到强烈抑制（图3b和补充图9）。值得注意的是，rEXS–cL–aV在诱导CEC死亡方面更有效，其效率分别比rEXS–fL–aV、aV和rEXS高出约2倍、3倍和6倍（图3c）。CLSM分析显示所有类型的外泌体都被巨噬细胞吞噬。

rEXS–fL–aV治疗导致巨噬细胞内aV的消耗，如巨噬细胞内aV和rEXS的共同染色所示；然而，在用rEXS–cL–aV治疗的巨噬细胞中很少观察到这种情况（图3d和补充图10）。这表明作者设计的可切割连接物可以减少巨噬细胞中aV的消耗，并提高其对CEC的生物利用度。此外，作者还检测了培养上清液中VEGF和炎性细胞因子的产生。用aV（aV、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治疗可有效降低可溶性VEGF浓度，而用rEXS（rEXS、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治疗可有效降低IL-6、IL-1β和TNF的产生（图3f）。总体而言，rEXS–cL–aV优于rEXS–fL–aV，并且在抑制炎症方面比其他治疗方法表现出更高的效率。这一结果得到了其对巨噬细胞中CD86上调进行抑制的支持（图3e和补充图11）。

4.在激光诱导的CNV小鼠模型中，眼内滞留、CNV损伤靶向和rEXS–cL–aV的时空耦合释放

作者在激光诱导的CNV小鼠模型中评估了其眼内药效学（图4a）。CNV诱导后，玻璃体内注射rEXS和aV（rEXS+aV）、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV的混合物。使用活体成像进行实时分析，量化aV（用Alexa Fluor 647标记）或rEXS（用DiR标记）在7d内的滞留和眼内分布。在用rEXS+aV治疗的小鼠中，玻璃体腔中的荧光aV信号在24h内减少一半以上，在96h内几乎消失，而rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV的荧光aV信号保留更长时间，注射后4d，信号超过50%或原始水平，注射后7d，信号约为25%（图4b，c）。aV生物利用度的提高可归因于外泌体的结合，这表明在玻璃体中消除缓慢。鉴于激光诱导的CNV病变主要位于黄斑部，作者检测了rEXS荧光信号，并计算了所有治疗中的前后比值。然而，三组房室荧光信号的前后比率不同。来自rEXS+aV治疗的自由递送的aV均匀分布，前后比为1，而来自rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV治疗的aV显示为3.5（图4b，d），表明aV与rEXS的结合促进了其在CNV病变中的积聚。rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV之间的aV信号强度具有平行性，从而支持了控制释放的假设，并证明在运输到CNV病变后部的时间之前，rEXS–cL–aV的aV释放可以忽略不计。通过分析整个眼球组织切片（补充图12），也证实了aV信号在整个玻璃体室中的明显扩散模式。rEXS集中趋向于于CNV病变的能力可能归因于炎症病变中趋化因子（如CCL20）的上调以及来自亲代Treg细胞的rEXS上趋化因子受体（如CCR6）的表达。

基于上述结果，作者使用四甲基异硫*酸罗丹明-右旋糖酐作为血管内对比剂和DiO标记的rEXS，在体内使用双光子荧光显微镜检测CNV病变中活跃新生血管的形成。成像结果显示rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV中的rEXS能够精确靶向CNV病变中形成的新血管（图4e）。最后，作者使用CLSM成像分析了眼球组织切片，以检查纳米药物积聚到CNV病变附近后，rEXS–cL–aV的aV切割情况。与rEXS–fL–aV处理的小鼠眼球组织中aV和rEXS信号的强烈重叠相反，rEXS–cL–aV样本中的两个信号之间存在重大偏差（图4f），这可归因于由于炎症病变中MMP水平显著增加，连接子的有效切割从rEXS–cL–aV释放aV（补充图13）。因此，rEXS–cL–aV表现出眼内滞留、CNV病变靶向性和时空控制释放，表明其潜在的后续治疗效果。

5.rEXS–cL–aV纳米药物在激光诱导CNV小鼠模型中的疗效和安全性

作者在激光诱导的CNV小鼠模型中测试了rEXS–cL–aV的治疗效果，评估了所有对照组的纳米药物，包括单个部分和rEXS–fL–aV（图5a）；对脉络膜新生血管组织进行了转录组分析；分析显示了来自前50个KEGG途径和前100个基因簇的数据。KEGG途径富集分析显示，rEXS–cL–aV治疗可调节与免疫调节（如细胞因子和趋化因子信号通路）和血管生成（如细胞粘附分子和粘着斑通路）相关通路中的基因表达。差异表达基因的分层聚类分析显示，rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV显著下调与炎症相关的基因（例如，Ly6c2、Il2ra、Il1b、Ccl5和Trbc1）。rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV也下调了具有与血管内皮细胞增殖和侵袭相关功能的基因（例如Adam7和Mmp8）（图5b）。因此，转录组学分析支持通过rEXS–fL–aV和rEXS-cL–aV治疗炎症和血管生成的协同靶向性。此外，与rEXS–fL–aV相比，rEXS–cL–aV治疗导致显著的基因下调，强调了aV反应性释放在CNV病变中的重要性。因此，与PBS对照组相比，rEXS–cL–aV治疗显著降低了房水VEGF（6倍）、IL-6（12倍）、IL-1β（3倍）和TNF（4.5倍）的水平，并优于所有其他对照组（图5c）。

为了直接评估治疗效果，作者使用眼底荧光血管造影（FFA）测量CNV病变中高荧光渗漏部位的数量和面积。使用rEXS或游离aV的单一疗法不足以显著减少高荧光渗漏。成像显示，与其他组相比，使用rEXS–cL–aV治疗的小鼠表现出高荧光泄漏量最少，平均泄漏数量减少到1.6。使用rEXS+aV或rEXS–fL–aV的联合治疗可导致高荧光泄漏部位减少（2-3倍），而rEXS–cL–aV可导致高荧光泄漏部位的显著减少，可减少8倍（图5d、g和补充图14a）。苏木精-伊红（H&E）染色rEXS–cL–aV治疗导致CNV病变厚度最小，表明CNV病变迅速消退（图5e，H）。

作者设计的rEXS–cL–aV能够在CNV病变附近以高浓度聚集，以减轻炎症，并在炎症环境中MMP催化裂解时特异性释放aV，从而抑制新生血管生成。免疫荧光染色显示F4/80⁺巨噬细胞和CD105⁺新生血管大量存在于未治疗小鼠的CNV病变中（图5f）。rEXS–cL–aV单药治疗显著降低巨噬细胞水平；然而，这种治疗对新生血管的影响微乎其微。相反，如巨噬细胞水平所示，单独使用aV治疗可抑制新生血管生成，但只能适度控制炎症。rEXS和aV的三种组合（rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV）治疗效果显示，rEXS–cL–aV的治疗效果最高。尽管其具有有效的抗血管生成活性，rEXS–cL–aV治疗没有改变眼压，也没有显示改变视网膜形态的迹象（图5i，j），支持局部组织的安全性。在系统水平上，rEXS–cL–aV治疗不会导致心脏、肝脏、脾脏、肺或肾脏的血液生化标记物或组织学特征发生任何可检测的变化，进一步支持玻璃体内给药的安全性。

6.rEXS–cL–aV在激光诱导的非人灵长类CNV模型中的治疗效果

在诱导CNV（每只眼睛中有九个激光点）后，向食蟹猴玻璃体内注射指定药物，并在20d后评估疗效。对脉络膜、脉络膜毛细血管、视网膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）层进行光学相干断层成像血管造影（OCTA）图像分割。成像显示，与其他组相比，经rEXS–cL–aV治疗的食蟹猴色素上皮脱落较少，平均数量减少至1.25（图6c，左图和补充图14b）。视网膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）的en face-OCT 图像显示了激光损伤点的最小水平尺寸（新形成的血管直径和水肿程度）（图6c，中间）。横截面图显示，与其他组相比，使用rEXS–cL–aV治疗的猴子显示出更高的CNV病变分辨率，导致最小的垂直尺寸（病变延伸至视网膜下间隙）（图6c，右侧）。CNV病变水平和垂直尺寸的定量分析证实rEXS–cL–aV在抑制新血管生长方面最有效（图6d）。与CNV中的结果相似，在小鼠模型中，rEXS–cL–aV的高效性伴随着VEGF和促炎细胞因子的显著降低。相比之下，rEXS单一疗法在减轻炎症方面优于aV单一疗法，而aV单一疗法在降低VEGF方面更有效（图6e）。

在安全性评估期间，作者使用裂隙灯观察角膜、前房或晶状体和眼压，观察到在接受或不接受rEXS–cL–aV治疗食蟹猴的眼睛各种指标均相似（图6f）。未经治疗和rEXS–cL–aV治疗的猴子血液学参数也相似，并且没有副作用的迹象（图6g和补充图17）。