光动力疗法(PDT)已经成为治疗癌症的一种有效方法。然而，PDT的治疗效果受到肿瘤中氧气（O2）供应不足和谷胱甘肽（GSH）过度表达的微环境的严重限制。在此，本团队提出了一种可生物降解的负载O2的CuTz-1@F127金属有机框架（MOF）治疗平台（表示为CuTz-1-O2@F127），可通过克服细胞内缺氧并降低肿瘤中的谷胱甘肽水平用于增强PDT。这种基于Cu(I)的MOF在近红外光照射和有H2O2存在的情况下能够发生类芬顿反应生成•OH和O2。同时，CuTz-1-O2@F127纳米颗粒（NPs）可以释放吸附的O2，进一步缓解细胞内缺氧。此外，CuTz-1@F127中的Cu(I)可以与细胞内的GSH反应，减少过量的GSH。这样，PDT的效率大大提高。尾静脉注射后，纳米颗粒通过在808nm激光照射下具有很好的协同抗肿瘤效果。更重要的是，NPs是可生物降解的，体内生物分布和代谢实验表明，近90%的NPs纳米材料可在30天内通过粪便和尿液排出，具有很好的临床转化前景。
研究内容及结果
1.CuTz-1@F127的合成与表征
据报道，CuTz-1可以表现出类似半导体的行为，并且能够在H2O2存在下在氙灯照射下发生类芬顿反应生成•OH。图1a表明，在涂覆F127前后，CuTz-1的形态变化不大。粉末X射线衍射(PXRD)分析(图1b)证实了纳米颗粒的结构。傅里叶变换红外光谱(FTIR)（图S3）和热重分析（TGA）（图S4）结果证明F127涂层成功。TGA曲线显示在CuTz-1上有大约10 wt%的F127涂层。此外，分别测量了悬浮在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中的CuTz-1和CuTz-1@F127的zeta电位、流体动力学大小和多分散指数。如图1c、d和图S5所示，涂覆F127后，平均zeta电位值从-5.6±0.3变为-1.2±0.1mV，动态光散射（DLS）数据显示平均流体动力学尺寸从170.1±11.5增加到186.4±16.7nm，多分散指数从0.27±0.03降低到0.14±0.03，表明CuTz-1@F127颗粒在生理环境中的溶解度和分散性增强。
图1
2.检测羟基自由基
•OH的产生首先通过检测3'-(对氨基苯基)荧光素的荧光增强(APF)，3'-(对氨基苯基)可以选择性地与•OH反应并变成高荧光。如图S7所示，在808nm激光照射下，在CuTz-1@F127 PBS溶液中，H2O2存在下观察到APF荧光明显增强。接下来，观察到CuTz-1@F127在激光照射下在H2O2存在的情况下有效降解RhB（图2a）。而且，DCFH-DA被用于监测细胞内ROS，由于DCFH-DA可以被细胞内的酯酶水解成DCFH，然后非荧光DCFH可以被•OH氧化成绿色荧光的二氯荧光素(DCF)。图S8表明CuTz-1@F127用808nm激光(0.6 W cm−2)照射10分钟，细胞内ROS的产生，绿色荧光表明在激光照射下进一步产生了•OH。
3.谷胱甘肽还原的体外研究
考虑到癌细胞中过量的谷胱甘肽会减弱PDT的有效性。该团队继续研究CuTz-1@F127是否能降低细胞内GSH。首先，在GSH存在下，CuTz-1@F127保持完整（图S9）。然后，使用GSH检测试剂盒测定保留在上清液中的GSH含量。如图2b所示，虽然GSH分子尺寸大于CuTz-1的孔径，但CuTz-1@F127在水溶液中与GSH混合后，CuTz-1@F127的BET表面积从184.5 m2g-1下降到 132.7 m2g-1。该小幅下降表明GSH分子与CuI位点结合并占据部分CuTz-1@F127的微孔。元素映射结果（图2d和图S11）确认硫元素均匀分布在基体中，进一步证明了CuTz-1@F127可以吸附GSH。此外，为了验证GSH对•OH氧化能力的影响，在RhB的降解实验中加入GSH，并引入TiO2（光催化剂）进行比较，如图2a所示，CuTz-1@F127和TiO2在808nm和氙灯激光照射下对RhB显示出优异的降解效率。然而，当添加GSH时，TiO2的降解能力严重减弱，CuTz-1@F127仍然可以降解近70%的RhB。这个结果表明CuTz-1@F127能有效降低GSH并保持•OH的杀伤力。
图2
4.氧气产生的体外研究
值得注意的是，MOFs是O2存储的良好候选者。该团队测试了CuTz-1@F127的O2吸附能力。氧吸附-解吸等温线（图2e）显示CuTz-1@F127可以吸附标准大气压和室温下高达400μmol g−1的O2。浸入O2后，得到CuTz-1-O2@F127（图1a）。为了证明CuTz-1-O2@F127的O2产生和释放性能，我们测量了808nm激光照射下的O2浓度。如图2f所示，在低H2O2浓度下，CuTz-1@F127 PBS溶液中观察到O2浓度增加，表明在类芬顿反应过程中产生了O2。由于在近红外光辐射刺激下CuI向CuII转化过程中会产生电子和空穴，可能导致CuTz-1-O2@F127可以释放癌细胞内吸附的O2，进一步缓解细胞内缺氧。最终，产生和释放的O2都可以克服细胞内缺氧，这在PDT中起着辅助作用。
5.细胞研究：细胞摄取、生物相容性和光细胞毒性
进一步进行体外实验研究CuTz-1-O2@F127的抗肿瘤功效。首先，倒置荧光显微镜图像显示纳米颗粒可能是在4小时内被4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）内吞（图S12）。然后，L929细胞（小鼠成纤维细胞）、HeLa细胞和4T1细胞用MTT细胞活力实验来检测生物安全性。如图3a所示，虽然CuTz-1-O2@F127的浓度为高达200×10−6 M，L929细胞的活力在孵育24小时后仍然接近100%，表明CuTz-1-O2@F127对正常细胞具有高度生物相容性。当CuTz-1-O2@F127的浓度超过100×10−6 M时，HeLa和4T1癌细胞的活性降低。这是因为CuTz-1-O2@F127可以吸附细胞内的GSH，并且GSH的减少影响癌细胞的正常生长，导致癌细胞和正常细胞活力的差异。接下来，CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127与4T1细胞一起孵育，在缺氧和常氧条件下，检测PDT效果。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光处理后，与4T1细胞孵育24小时，MTT法检测细胞活力。如图3b所示，缺氧处理组在光照下表现出比常氧细胞更高的细胞存活率。该结果表明细胞内缺氧促进癌细胞增殖，进一步说明了肿瘤治疗过程中克服缺氧的重要性。正如预期的那样，CuTz-1-O2@F127+光处理组在缺氧条件下的治疗效果与常氧条件下相似，并且治疗效果随着CuTz-1-O2@F127浓度的增加而增加。流式细胞术分析（图S13）进一步证明了CuTz-1-O2@F127+光处理组显示出低的肿瘤细胞存活百分比（约21.1%）。
图3
6.ROS和缺氧的细胞内检测
使用ROS-ID缺氧/氧化应激检测试剂盒来研究细胞内ROS和缺氧。如图3c所示，对照组在没有光照的情况下没有产生活性氧；然而，在缺氧和常氧条件下，808nm激光照射组均检测到强ROS信号，表明I型PDT过程即使在缺氧条件下也能产生大量的•OH。此外，近红外光照射后，CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光组在缺氧条件下处理的细胞显示比未照射的红色荧光弱，表明CuTz-1@F127在NIR照射下可以在细胞中产生O2，CuTz-1-O2@F127+光组显示出比CuTz-1@F127+光组更弱的红色荧光，表明CuTz-1-O2@F127可以进一步释放它携带的O2以缓解癌细胞的缺氧。
图3
7.活/死细胞染色分析
为了进一步检查CuTz-1 MOF系统在缺氧条件下的细胞光毒性，通过Calcein-AM/PI双染试剂盒区分活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。如图3d所示，作为对照组，所有未经处理或用PBS+光、CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127处理的细胞，细胞均显示绿色荧光，表明细胞几乎没有损伤。在808nm激光照射下，CuTz-1@F127处理组观察到细胞显示很微弱的绿色荧光，表明大多数细胞死亡。用CuTz-1-O2@F127+光处理组观察到细胞显示红色荧光，表明细胞均死亡。这些结果进一步表明CuTz-1-O2@F127在克服缺氧以增强癌细胞的PDT方面具有优越的治疗效果。
8.体内肿瘤抑制能力
随着PDT效应在体外被广泛研究和认可，进一步研究了CuTz-1-O2@F127在4T1荷瘤小鼠上体内的治疗效果。实验设计了六组带有4T1肿瘤的雌性Balb/c小鼠（n=5），分别通过尾静脉注射方法对其进行治疗。每只按照20mg/kg的剂量注射，对照组为PBS，实验组为PBS+光、CuTz-1@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O2@F127和CuTz-1-O2@F127+光。每2天测量体重和肿瘤大小。图4a显示各组小鼠的体重随着时间的推移逐渐增加，表明这些操作对小鼠的副作用很小。图4b显示了随着时间的推移对肿瘤的治疗效果。与对照组相比，CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127治疗组均表现出一定的抑瘤作用。这是因为CuTz-1@F127可以降低肿瘤中GSH的水平（图4c），从而影响癌细胞的正常生长。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光治疗组的肿瘤被有效抑制。此外，由于更多的O2补充，CuTz-1-O2@F127+光组表现出好的肿瘤抑制效果。上述结果表明，载氧MOF治疗系统在808nm激光照射下可实现有效肿瘤抑制。治疗14d后，处死所有小鼠，切除肿瘤并称重。图4d和图S14显示，CuTz-1-O2@F127+光组中的肿瘤生长明显受到抑制，可增强PDT疗效。对肿瘤组织进行原位苏木精和伊红(H&E)染色，如图4e所示，在CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光组都可以观察到明显的肿瘤组织坏死，表明•OH的杀伤力。同时，CuTz-1-O2@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O2@F127+光各处理组和对照组的肝、脾、肺、肾、心脏等主要器官的H&E染色图像显示没有发现明显的组织损伤（图S15）。正如预期的那样，表明CuTz-1-O2@F127具有良好的生物安全性。
图4
9.体内长期毒性、生物分布和代谢研究
CuTz-1-O2@F127的长期毒性和体内生物分布是通过对Balb/c小鼠进行静脉注射NPs实现的。如表S1所示，血清生化数据显示治疗组与对照组之间没有主要参数差异，包括心功能的肌酸激酶（CK）；肾功能的血尿素(BUN)和血清肌酐(CRE)；肝功能的谷丙转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。为了确定体内CuTz-1-O2@F127 NPs的生物分布，在尾静脉注射后定期收集所有小鼠的肿瘤和主要器官。铜浓度用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)进行检测。如图5a所示，在静脉注射后的前12小时内，注射的NPs主要被肝脏和脾脏吸收。因为EPR效应，大量NPs可在肿瘤部位蓄积，24h左右达到最大值。然后随着时间的延长，被检测器官中的NPs减少。进一步研究了小鼠中NPs的代谢情况，有趣的是，如图S16和S17所示，SEM和PXRD数据显示CuTz-1-O2@F127在第五天开始分解。在第10天，CuTz-1-O2@F127完全失去了其形态和晶体结构。因此，进一步测量了注射CuTz-1-O2@F127的小鼠在不同时间点收集的粪便和尿液中Cu含量。在早期，肝脏中积累的NPs主要通过胆汁排泄到粪便中，一周后，降解后的NPs可通过肾脏排出，形成尿液（图5b）。第14天，NPs随尿液排出达到最大值。此后，排出量逐渐减少，30d后，NPs通过粪便和尿液以90%的高比率排出。这个现象表明虽然CuTz-1在GSH水溶液中稳定，但由于其复杂的TME和可生物降解性，可以排出体外，这极大地证明了CuTz-1-O2@F127的生物降解性。
图5
结 论
总之，我们开发了用于增强癌症PDT疗效的CuTz-1-O2@F127治疗平台。这种纳米级MOF治疗剂的制造简单明了。该研究证明了使用CuTz-1-O2@F127作为潜在的PDT试剂，它具有出色的产生•OH和克服细胞内缺氧的能力，以及降低细胞内GSH水平的能力。尽管对I型PDT机制的阐述，尤其是O2是否起作用，仍有争议。但体外和体内实验表明，克服缺氧可以增强PDT疗效。更重要的是，一个月后CuTz-1-O2@F127可以通过粪便和尿液以90%的高比率排出小鼠体外，这对于纳米医学在临床应用方面具有潜在的意义。