1冷冻管应如何解冻?
取出冷冻管后,须立即放入37°C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
2细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO?
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3可否使用与原先培养条件不同之培养基?
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。
4可否使用与原先培养条件不同之血清种类?
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5何谓FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,两者都是指胎牛血清,FCS乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。
6培养细胞时应使用5%或10%CO2?或根本没有影响?
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时,细胞培养时应使用10%CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时,则应使用5%CO2培养细胞。
7何时须更换培养基?
视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8培养基中是否须添加抗生素?除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。
9附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度?应如何处理?
一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。
10悬浮性细胞应如何继代处理?
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。
11欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?
欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg(约1,000rpm)5-10分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。
12细胞之接种密度为何?依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13细胞冷冻培养基之成份为何?
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
14DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?
冷冻保存使用之DMSO等级,必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
15冷冻保存细胞之方法?
冷冻保存方法一:冷冻管置于4°C30~60分钟→(-20°C30分钟*)→-80°C16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-20°C不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
16细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。
17应如何避免细胞污染?细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
18如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
直接灭菌后丢弃之。
19支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
20支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
21侦测出细胞株有支原体污染时,该如何处理?
直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。
22CO2培养箱之水盘如何保持清洁?
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
23为何培养基保存于4°C冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?
培养基保存于4°C冰箱中,培养基内之CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH值。
24各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?
不同厂牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。
25购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
26购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。
27收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?
冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧.
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细胞培养常见问题分析
作者:北京雅安达生物技术有限公司 2014-08-11T00:00 (访问量:2726)
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