在蛋白质组学研究中，PRM（Parallel Reaction Monitoring）技术因其特异性强、灵敏度高而被广泛应用于生物标志物验证、机制研究与生物药开发等领域。尤其是在高分辨率质谱平台Orbitrap上的应用，使得PRM的定量准确性和重复性达到新的高度。然而，实现真正的精确定量并非仅依赖于仪器性能，更需在样本准备、方法开发、参数设定、数据采集与分析等每一环节精益求精。本文将系统解析如何在Orbitrap平台上优化PRM分析流程，帮助研究人员提升数据质量与研究效率。

一、样本制备：精准定量的前提保障

1、样本类型与保存策略

PRM分析对样本质量极为敏感，推荐使用以下类型：

（1）组织样本： 肿瘤、心脑组织等需快速冷冻，-80℃储存；

（2）细胞样本： 采用胰酶消化或刮板收集，加入裂解液立即处理；

（3）体液样本： 如血清、血浆、脑脊液等，采集后应快速离心除杂、分装冷冻。

避免多次冻融是确保蛋白完整性和定量一致性的关键。

2、蛋白提取与消化标准化

（1）裂解液选择： RIPA适用于多种细胞结构，8M尿素用于难溶蛋白提取。

（2）还原与烷基化： 使用DTT（或TCEP）还原二硫键，IAA封闭游离巯基，保障酶解一致性。

（3）酶解： 常规使用Trypsin按1:50比例（酶:底物）过夜酶解，37℃保温；

（4）纯化： 采用C18柱纯化脱盐去杂质，提高肽段质量与MS兼容性。

确保前处理一致性是实现精确定量的基础，建议引入QC样本监控操作波动。

二、靶标肽段筛选与稳定同位素内标设计

1、肽段筛选逻辑

（1）来源多样： 可基于DDA结果、文献数据或公共数据库（如PeptideAtlas）；

（2）筛选标准： 不含修饰位点、跨膜区域与共享肽段，保留时间稳定、响应强；

（3）目标数量： 单项目推荐每个蛋白选2-3个高质量肽段用于验证。

2、内标肽（SIS）设计与应用

（1）合成方式： 通常使用13C/15N标记氨基酸标记目标肽段；

（2）加入时机： 建议于酶解后加入，避免因样本处理损耗带来的误差；

（3）定量模式： 可用于相对定量（归一化）或构建标准曲线实现绝对定量。

内标的存在极大提升了PRM的重复性与跨批次一致性，是精确定量不可或缺的关键。

三、方法开发与Orbitrap参数优化指南

1、质谱方法设置

（1）前体离子选择： 根据响应强度、碎片谱图选择主m/z值；

（2）碎片离子设定： 选取多个强度高、无干扰的碎片离子，确保定量准确；

（3）RT窗口安排： 使用RT scheduling功能精准采集，提高采集效率与特异性；

2、Orbitrap平台核心参数

（1）分辨率： 建议设置在30,000–60,000（MS2），高分辨提高背景分离能力；

（2）注入时间（IT）与AGC： 通常设置IT为80–150ms，AGC target为1e5–2e5，根据靶点强度优化；

（3）Isolation Window： 设定为1.2–2.0 Th，兼顾灵敏度与特异性；

（4）动态排除： 开启有助于避免干扰重复扫描，提高采集效率。

四、数据采集与Skyline分析流程详解

1、原始数据采集要点

（1）QC策略： 每10个样本注入一次QC样本，监控仪器状态与样本一致性；

（2）监控指标： 总离子流（TIC）、保留时间稳定性、SIS峰响应、背景噪声水平等；

2、Skyline分析流程全解析

（1）导入raw文件与PRM方法配置： 设置靶标序列、m/z值、RT窗口；

（2）提取XIC与峰识别： 自动调用碎片离子色谱图，选择峰面积最大区域；

（3）RT校准与内标比值计算： 校正保留时间偏移，计算SIS/Target比值；

（4）标准曲线拟合（如适用）： 构建线性拟合曲线，计算LOD/LOQ；

（5）批量归一化与可视化： 使用热图、火山图、PCA呈现结果；

（6）统计分析： 进行t检验、ANOVA、多重假设校正等。

Skyline的使用贯穿PRM数据处理始终，是提升定量效率与质量的核心工具。

五、优化建议与常见问题解答（FAQ）

Q1：低丰度蛋白信号弱，如何优化？

优化酶解条件或使用免疫富集策略；延长质谱注入时间，提高靶肽捕获能力；优选响应更强、背景干扰更低的替代表肽段。

Q2：靶点过多采集不全怎么办？

启用时间窗口调度（RT scheduling），避免同时间扫描过多肽段；按功能或表达量分批采集，或采用多轮运行策略。

Q3：结果波动大，可能的原因？

内标响应不稳：建议更换或重新合成SIS；酶解效率波动：增加QC样本，监控酶解一致性；仪器状态不稳：定期维护并做好每日性能验证。

百泰派克生物科技凭借丰富的靶标经验与强大的Orbitrap Exploris平台，建立了标准化、高通量的PRM分析服务体系，服务涵盖：

• 靶标选择与SIS合成建议
• 方法开发与Skyline模板配置
• 多样本、跨批次标准化分析
• 可视化报告（含火山图、热图、PCA）+ RAW原始图谱交付

我们支持癌症、代谢病、炎症、自免等多领域研究，从科研探索到临床转化，提供值得信赖的技术支撑。PRM不仅仅是一种定量手段，它是连接“发现”与“验证”的核心桥梁。要在Orbitrap平台上实现真正可靠的蛋白质定量结果，必须从样本质量、靶标选择、内标引入、参数设定到数据处理全过程优化。百泰派克生物科技通过多年实践与技术积累，为科研人员提供高覆盖率、高重复性、高解读力的PRM解决方案。让每一次分析，不止于结果，更指向科学的深度洞察。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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