天然腔肠荧光素背景描述

腔肠素（Coelenterazine）是自然界中资源最丰富的天然荧光素，是绝大多数海洋发光生物（超过75%）的光能贮存分子。腔肠素可作为许多荧光素酶的底物，比如海肾荧光素酶（Rluc），Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc），以及包括水母发光蛋白（aequorin）和薮枝螅发光蛋白（Obelia）在内的光蛋白（Photoproteins）。其发光原理是：以腔肠素为底物的荧光素酶在有分子氧的条件下，氧化腔肠素，产生高能量的中间产物，并在此过程中发射蓝色光，峰值发射波长约为450~480nm。与甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶系统不同，腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更便于体内生物荧光的研究。因此，腔肠素常用作基于荧光分析的报告基因检测以及活体动物检测的发光底物。

腔肠素还能在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚**阴离子能够增强该自发光信号，因此其也可用来检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平。

腔肠素具有能量转移的特性— —生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET），利用此特性，当与荧光蛋白如GFP的突变体（增强的黄色荧光蛋白，EYFP）联合使用，在底物腔肠素存在的情况下，荧光素酶（如Rluc）催化底物发生蓝光，能量随之转移到EYFP上，发出绿光（~530nm）。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者间的相互关系来评估，适用于研究蛋白-蛋白之间的相互关系。另外，由于BRET的信号可通过比较绿光和蓝光的量来进行测定，消减了因细胞数、细胞类型和其他实验变量而引起的数据变量，适用于高通量筛选如药物开发。

更为重要的一个功能，水母发光蛋白复合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔肠素组成。只有当钙离子（Ca²⁺）与该复合物结合后，腔肠素才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO₂和蓝色荧光（~466 nm）。正是此Ca²⁺依赖性的反应过程（见图1），使得腔肠素非常适用于监测活细胞内钙离子水平。与常规的荧光钙离子指示剂相比，其主要具有以下几个优点，1）能检测较大范围的钙浓度 – 从0.1 μM至 >100μM；2）样品无自体荧光，背景荧光低于使用荧光钙离子指示剂；虽然信号比使用荧光钙离子指示剂弱，但是通过成像仪器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的灵敏度。3）水母发光蛋白复合体能够稳定维持在细胞内，使其能够进行数小时至数天的钙离子监测。 

图1. 腔肠素作为水母发光蛋白辅助因子的Ca²⁺依赖反应流程

 目前商业化的腔肠素应用最普遍的是天然腔肠素（Coelenterazine native），另外还有很多腔肠素衍生物如Coelenterazine h、Coelenterazine 400a、Coelenterazine cp、Coelenterazine f、Coelenterazine hcp、Coelenterazine n等被一一合成。理论上这些腔肠素可用于相同的实验，但是由于其发光波长，细胞膜渗透性，光量子效率上的差异，使得其在相同应用上表现出不同的实验效果。因此非常有必要根据具体实验目的选择最合适的腔肠素底物（见附录1，腔肠素及其衍生物的特性）。

 天然腔肠荧光素产品描述

本品为粉末形式供应的天然腔肠素（Coelenterazine native），是海肾荧光素酶（Rluc）和Gaussia荧光素酶（Gluc）等多种荧光素酶的作用底物，也是水母发光蛋白的辅助因子，应用非常广泛，可用于检测活细胞中钙离子浓度，基因报告分析，BRET（生物发光共振能量转移）研究，ELISA，HTS，以及组织或细胞中ROS水平的化学发光检测。

产品性质

中文别名（Chinese synonym）	天然腔肠素；腔肠素游离酸
英文别名（English synonym）	3,2-Dihydro-2-(p-hydroxybenzyl)-6-(p-hydroxyphenyl)-8-benzylimidazolo[1,2-a] pyrazin-3-one CLZN; Renilla luciferin; Coelenterazine free base
CAS号（CAS NO.）	55779-48-1
分子式（Formula）	C26H21N3O3
分子量（Molecular weight）	423.46 g/mol
外观（Appearance）	棕黄色粉末
溶解性（Solubility）	溶于甲醇或者乙醇，不可溶于DMSO
纯度（Purity）（TLC）	>95%
结构（Structure）

 天然腔肠荧光素运输和保存方法

冰袋运输。粉末-20℃避光干燥保存，最好保存在惰性气体下以避免接触空气。

使用方法

1. 腔肠素工作液的配制

腔肠素溶解特性：腔肠素及所有衍生物都溶于乙醇或者甲醇，切忌溶于DMSO。腔肠素的水溶性相当低，一般情况需用酸化的甲醇配制高浓度母液后再用水溶性缓冲液稀释到需要的工作液，现配现用。有文献报道，含有50 mM的2-羟丙基β环糊精的pH 7.0缓冲体系中可溶解配制＞1 mM的水溶液。目前来看，比较稳定的溶剂是丙二醇，商业化或我司提供的即用型腔肠素h（货号：40907ES10）使用的是丙二醇和/或乙醇的混合溶剂，稳定性高，非常适用于体内动物活体成像研究。

腔肠素母液的配制：称取1mg腔肠素粉末直接溶解于197µl酸化的甲醇溶液（100%甲醇中含有20µl/ml 3M或者6M HCl），配制成12 mM（~5mg/ml,5×）的腔肠素储存液。-20℃（最好-80℃）分装避光保存，可能会有少量活性的丧失，但可保存4周。若存放在惰性气体中可长期保存。

腔肠素工作液的配制：可直接用脱气蒸馏水（去离子水），PBS或者其他类型生理缓冲液稀释。现配现用。可直接用不含Ca²⁺/Ma²⁺的PBS缓冲液将12 mM的储存液稀释到2mM（~1 mg/ml）的工作液，4°C避光短暂存放。若是体外实验，需要使用前室温平衡15-20min。

2. 体内动物成像检测

1）动物经麻醉后，视情况决定是否去皮（一般而言，黑色皮毛动物需进行此步操作）；

2）使用26-gauge针头注射器尾静脉注射给药100µl 2 mM (~1mg/ml, 1×)工作液，然后将动物立即放到BLI仪器内成像，以获得峰值信号。

3. 体外生物发光检测

1) 使用管光度计室温下定量检测发光情况，每个样品做三个平行；

2) 加入10 µM底物10s内立即检测荧光信号，“integration time”为1s。

 天然腔肠荧光素注意事项

1) 腔肠素粉末或者储存液最好使用惰性气体-氮气或氩气，在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，长期保存于-80℃。管内即使有少量空气进入，也可能造成腔肠素氧化失活，使量化分析的结果难以在不同试验间进行比较。

2) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。