产品简介

ClearV 488 Caspase-3活细胞检测试剂盒包含ClearV 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制剂。ClearV 488 Caspase-3 Substrate基于Caspase-3/7活力检测细胞凋亡，适用于荧光显微观察和流式细胞仪分析。

相较于其它基于FLICA分析的试剂盒，试剂盒内提供的Substrate在检测Caspase-3/7活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate最初无荧光，其会穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中Caspase-3/7剪切Substrate释放高亲和性的DNA染料，这种染料迁移到细胞核标记DNA并发出明亮的绿色荧光。Substrate是双功能的，既可以检测Caspase-3/7活性，又能可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。ClearV染色可以进行甲醛固定并兼容后续免疫染色实验。

光谱特性ClearV : Ex/Em=500/530nm（with DNA）

产品规格

组分信息

储存条件

冰袋（wet ice）运输。储存于4ºC，至少可以储存12个月。

注意事项

1. 细胞可用Hoechst 33342染料（推荐浓度1 μM）共染，使细胞核产生蓝色荧光染色（Ex/Em=346/460 nm）。
2. ClearV 488染料可用甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。
3. 经甲醛固定的ClearV 488染色细胞可用0.1% TritonX-100处理后进行后续染色，但这样处理后的染色亮度可能会减弱。
4. 操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。
5. 本产品仅用于科研。

使用说明

1. 实验优化

下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。ClearV 488 Substrate可进行细胞长时间孵育过程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。推荐底物浓度1-10 μM之间。细胞可在培养基、PBS或其他的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞，建议更换新鲜含有底物的培养基，以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞等操作可自由选择。

1. 对照设定

推荐设定以下对照：

A. 阴性对照：不诱导凋亡的细胞

B. 阳性对照：诱导凋亡的细胞

C. 抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时（或提前10-30 min）孵育Caspase-3/7抑制剂，最后再添加ClearV 488 Caspase-3底物。

1. 抑制剂对照

试剂盒中所提供的Caspase-3/7 抑制剂Ac-DEVD-CHO可用来确认Caspase-3/7依赖于ClearV 488的荧光信号。对于抑制剂对照，抑制剂的终浓度应至少是底物浓度的2倍（例如当使用5 μM ClearV 488底物时，Ac-DEVD-CHO浓度为10 μM）。添加底物前在室温下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后，孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO是可逆的竞争性抑制剂。对于某些细胞类型有效的Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂，如Z-DEVD-FMK，或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。

1. 流式细胞仪分析

1. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
2. 对于贴壁细胞，实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。
3. 用细胞培养基或合适缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到10⁶个/mL数量级。
4. 添加200 μL细胞悬液至流式细胞试管。
5. 抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO处理细胞（见上文）。
6. 200 μL细胞悬液中加5 μL 0.2 mM的Substrate并立即混匀使底物浓度为5 μM。不同类型细胞最佳底物浓度可能不同，需进一步优化。
7. 室温避光孵育15-30 min。
8. 加入300 μL细胞培养基或PBS，使用流式细胞仪分析，选择检测绿色荧光的通道（激发/发射：485/515 nm）。

1. 荧光显微镜观察

1. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
2. 抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文）。
3. 用含5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。
4. 室温孵育30 min 或更长时间。
5. PBS或其它缓存液清洗细胞，荧光显微镜观察细胞，使用观察绿色荧光的滤片（激发/发射：485/515 nm）。

1. 荧光酶标仪检测

1. 将贴壁细胞生长在黑色96孔板中；对于悬浮细胞，调整密度至10⁶个/mL，每孔加入0.2 mL细胞悬液。
2. 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

【注意】细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到96孔检测板。

1. 抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO处理细胞（见上文）。
2. 对于悬浮细胞，直接添加Substrate混匀。对于贴壁细胞，用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。
3. 细胞可以在含有Substrate的培养基中直接观察。
4. 对于悬浮细胞，轻轻震荡重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部阅读方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。