BrdU，英文全称5-bromo-2′-deoxyuridine，中文全称5-溴-2’-脱氧尿苷，是一种合成的胸苷溴化类似物，在S期可替代胸苷选择性插入细胞DNA。BrdU通常和广泛用于测定DNA合成和标记分裂细胞，最后用来研究诱导细胞增殖的信号通路和其他生理过程。BrdU通过体外细胞培养或体内注射的方式进行探针加载，然后用抗BrdU的抗体进行特异性检测。

BrdU标记后，对组织或细胞进行固定和透化后，需要额外的DNA水解步骤（有时也称DNA变性），从而允许抗BrdU的抗体能够与插入DNA的BrdU结合。BrdU抗体能够与其他细胞标记物如Ki67，双皮质素（DCX）和NeuN联合使用来鉴定增殖细胞和新分化神经元。

使用说明：

1. BrdU标记：体外标记细胞

制备BrdU储存液（10mM）：称取3mg BrdU（Mw：307.10）溶于1ml去离子水，充分溶解即可。

用细胞培养基按照1:1000的比例将储存液稀释到10μM BrdU染色液，并在无菌条件下用0.2μm滤膜对染色液进行过滤除菌。

吸掉细胞内培养基并更换无菌的10μMBrdU染色液，置于CO2培养箱37ºC孵育1-24h。【注意】：BrdU孵育时间取决于细胞分裂速度。原代细胞可能要高达24h，但快速增值细胞系可能仅需1h。达到最佳信噪比的时间需要通过优化条件来确定。

吸掉细胞内染色液，用PBS清洗2次，每次至少5s。

根据标准免疫细胞化学（ICC）操作流程进行细胞固定和透化。但是在开始免疫染色前需参照下述的DNA水解步骤。

2.BrdU标记：BrdU体内标记

【注意】：BrdU体内标记方法比较多，常见的有腹腔注射法（Intraperitoneal injection）和口服法。以下为腹腔注射法的步骤，其他方法可参考文献或根据实验室固有经验操作。

用1×PBS溶解适量的BrdU配制成10mg/ml储存液，过滤除菌，按照单次用量分装冻存后待用，避免反复冻融。

对于小鼠，通用情况注射浓度为100mg/kg。

BrdU标记完成后，根据实验室已成的步骤处理动物。【注意】：BrdU插入快速分化组织比如小肠，在注射后30min就能检测到。但大多数组织可能需要高达24h才能检测到。合适的处理时间和注射剂量需要根据组织类型来优化。

3. DNA水解（DNA变性步骤）

3.1 细胞样本

用1-2.5M HCl室温孵育细胞10min-1h，实际的HCl浓度和孵育时间根据实验来优化。如果使用更短的孵育时间，37°C孵育可能比室温孵育效果更好

可选步骤：去除HCl，用0.1M硼酸钠缓冲液，pH 8.5室温中和30min。【注意】：0.1M硼酸钠缓冲液（pH 8.5）配置方法：称取3.8g硼酸钠（Mw=381.4）加入100ml蒸馏水，充分溶解后，用NaOH调整到所需pH。

用PBS清洗3次，每次不少于5s。

根据标准ICC操作流程继续后续染色。

3.2 组织切片

【注意】：对于石蜡切片必须先做脱蜡处理再进行DNA水解步骤。

用1-2 M HCl室温孵育切片30min-1h，实际的HCl浓度和孵育时间根据实验来优化。如果使用更短的孵育时间，37°C孵育可能比室温孵育效果更好。

可选步骤：去除HCl，用0.1M硼酸钠缓冲液（pH 8.5）室温中和切片10min。【注意】：0.1M硼酸钠缓冲液，pH 8.5配置方法：称取3.8g硼酸钠（Mw=381.4）加入100ml蒸馏水，充分溶解后，用NaOH调整到所需pH。

用PBS清洗3次，每次不少于5s。

根据标准IHC操作流程继续免疫染色步骤。

注意事项：

1）BrdU是一种诱变剂，操作过程一定要注意防护，不要与皮肤直接接触。另戴口罩避免粉尘吸入。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

相关内容（与anti-BrdU的共染色）

目的：BrdU常与其他抗体联合使用以鉴定增殖和新分化神经元。常见以下3个指标：

Ki67：反映增殖的细胞标记物，细胞周期G1，S，G2和M期有Ki67表达，但静止期G0无Ki67表达。Ki67抗体能够替代或与Brdu联合使用来标记增殖神经元。

双皮质素（Doublecortin，DCX）：微管相关的磷酸蛋白，由未成熟神经元表达。可与BrdU联合使用鉴定未成熟的有丝分裂后神经元。