辅酶Ⅰ含量测定试剂盒 微量法
产品名称: 辅酶Ⅰ含量测定试剂盒 微量法
英文名称: Micro NAD(H) Kit
产品编号: BC0315
产品价格: 0
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
品牌商标: Solarbio
更新时间: 2024-12-24T14:03:51
使用范围: null
- 联系人 : 索莱宝-龚思雨
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- 所在区域 : 北京
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产品内容:
酸性提取液:25mL×1 瓶,4℃保存;
碱性提取液:25mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 1.5mL×1 支,4℃保存
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 1.6mL 双蒸水,混匀,4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 1.9mL 双蒸水,混匀,4℃保存一周;
试剂五:液体 0.7mL×1 支,4 ℃保存;
试剂六:液体 10mL×1 瓶,4 ℃保存;
试剂七:自备。19.2mL 乙醇和 0.8mL 蒸馏水充分混合备用。
NAD 标准品:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水,即 2umol/mL,将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。
NADH 标准品:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入 1.4mL 蒸馏水,即 2umol/mL,将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。
操作步骤:
一、NAD+和 NADH 的提取:
1、血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 酸性提取液,煮沸 5min (盖紧,以防止水分 散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取上清 200uL,加入等体积碱性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。
NADH 的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 碱性提取液,煮沸 5min(盖紧,以防止水分 散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积酸性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。
2、组织中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防 止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积碱性提取液混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。
NADH 的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防 止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积酸性提取液混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。
3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:
NAD+的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎 1min(强度 20% 或 200W,超声 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min,取上清液 200uL 至另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃ 离心 10min,取上清,冰上保存待测。
NADH 的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎 1min(强度 20% 或 200W,超声 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min,取上清液 200uL 至另一新的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃ 离心 10min,取上清,冰上保存待测。
二、测定步骤:
1、可见分光光度计/酶标仪调节波长至570nm,蒸馏水调零。
2、 操作表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样)
试剂名称 | 对照管(μL) | 测定管(μL) | NAD 或 NADH 标准管 | 空白管 |
上清液 | 10 | 10 |
|
|
标准溶液 |
|
| 10 |
|
蒸馏水 |
|
|
| 10 |
试剂六 | 100 |
|
|
|
试剂一 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂四 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂五 | 7 | 7 | 7 | 7 |
充分混匀,室温避光静置20min | ||||
试剂六 |
| 20 | 20 | 20 |
充分混匀,静置5min后,15000rpm,25℃离心15min,弃上清,沉淀中加入: | ||||
试剂七 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀, 570nm 下比色,读取吸光值ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,NAD 标准管的记为ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。 NADH 标准管的记为ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。空白管只需做一 到两次。
注意事项:
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加,必须分开加。
2、反应过程要注意避光。
3、当吸光值大于 1 时,建议稀释后测量,计算公式中应当乘以稀释倍数。
NAD+含量的计算
1、 血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
(2)按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/10 4cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
NADH 含量的计算
1、 血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷V 血清 =12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2
2、组织中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷(V 样品×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2