G5超保真PCR Mix

描述：该制品系专为 RNA 样本的 LAMP 扩增反应设计， 制品中 Bst 4.0+ Polymerase 中包含 Bst 2.0 DNA 聚合 酶、 极其耐热 ThermoStable V 反 转录酶、Rnase Inhibitor，在 RNA 的 LAMP 扩增中无需再加入任何其它 酶制品即可用于 RNA 的 LAMP 扩增。除此外，Bst4.0+ DNA Polymerase 聚合酶中不含有甘油成分，因此可用于 建立 LAMP 引物 mix 与酶制品的冻干品，以提高 LAMP 检测制品的稳定性和易用性。 Bst 4.0+ Polymerase 可搭配不同的反应 Buffer 从而 实现不同的显色与检测方式。三种Buffer均已包含dNTP、 Mg 2+和相应的反应缓冲盐。其中 2xRed LAMP BufferD 用于红黄变色反应，扩增完毕后阳性样品为黄色，阴性样 品为红色；2xSG LAMP BufferD 包含 SYBR Green 染料 用于实时荧光检测；2xLAMP BufferD 用于浊度分析、浊 度仪或搭配 OG 橙绿变色反应管（阳性样本为绿色、阴性 样本为橙黄色，A3821）。 货 号 名 称 A3825 Bst4.0+ Polymerase (250 μl) A3825-01 2xRed LAMP BufferD (1 ml) A3825-02 2xLAMP BufferD (1 ml) A3825-03 2xSG LAMP BufferD (1 ml) 注意：Bst4.0+ Polymerase：2.5μl 该制品包含 8U Bst2.0 DNA Polymerase、20U ThermoStable V反转录酶、8U Rnase Inhibitor、22%海藻糖，不含甘油，可用于冻干。 储存：长期保存于-20℃，可保存 2 年。短期保存置于 4℃， 保存 3 个月，避免反复冻融。 使用方法： 1. 配制反应体系 在 0.2ml EP 反应管中加入下述试剂 2xLAMP BufferD 10 μl Bst4.0+ Polymerase 2.5 μl 10xLAMP Primer Mix 2 μl 模板 RNA X μl ddH2O 到总体积 20 μl 10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、 LoopF/B 分别为 4 μM、F3/B3 分别为 2 μM 2. 反应体系配好后，置于 60~68°C（首次实验采用 65°C） 进行反应 20~45min。 3. 引物及酶制品的冻干（可参考） Bst4.0+ DNA Polymerase 2.5 μl 10xLAMP Primer 2 µl 45%海藻糖 0.5 μl Total 5 μl 将该制品进行冻干处理，获得冻干品。 4. 冻干制品的 LAMP 扩增 向一份冻干品中加入 10 μl 的 2x Red LAMP BufferD 溶解冻 干制品，并加入最多 10 μl 的检测 RNA 模板(总体积为 20 μL) 进行 LAMP 扩增。 

G5 超保真DNA聚合酶(性能等同于NEB Q5超保真DNA聚合酶)来源于高保真Pfu DNA聚合酶，具有很强的3’-5’外切酶活性。经基因工程改造后，其具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力，此外其还具有6kb/min的延伸速度。扩增能力强、保真性高，可用于载体构建、突变修复、基因合成、DNA测序等对保真性能要求较高的试验。该酶的扩增产物为平端产物，不含“A”尾。该酶以λDNA为模板扩增20kb基因片段，以人基因组为模板扩增12kb的基因片段。 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix（性能等同于NEB Q5热启动超保真PCR Mix）是经优化的即用型PCR预混物，含有经抗体封闭的热启动G5 超保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂，使用时只需加入模板、引物和灭菌水即可进行PCR扩增，大大简化了操作过程、提高了效率、减少了PCR操作过程中的人为误差。具有快速简便、重复性高、特异性好、灵敏度高和稳定性好的特点。该制品中已经含有溴酚蓝染料，PCR扩增完毕后可直接点样于琼脂糖凝胶，无需再加入DNA Loading Buffer。

组份

名称 40T(50μl体系) 200T(50μl体系) 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 0.4 ml 0.4 ml x5

主要特征

具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力。 顶级的扩增速度，在目的条带≤2kb时扩增速度可达4kb/min以上。 具有良好的模板兼容性，对于基因组、质粒、cDNA、λDNA模板都有良好的扩增。 优异的长片段扩增能力，以λDNA为模板可扩增20kb产物。 良好的扩增灵敏度，人基因模板低至1ng也可以有效扩增。

应用

基因合成、突变修复和平端克隆。

储存

长期储存置于-20°C以下，可保存2年，避免反复冻融；短期使用置于4°C（3个月）保存，一经融化后请放置于4°C，勿再冻存。

实例

1. 良好的模板兼容性和长片段扩增

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix以 Gdna(A)、λDNA(B)、Hela Cdna(C)为模板扩增不同靶基因，结果显示5XHotStart HiFi G5 PCR Mix具有优异的长片段扩增能力，基因组可达12kb以上、λDNA可达20kb以上、Hela cDNA可扩增至7.6kb以上。 A: 1~5 分别为以gDNA为模板扩增的500bp、2kb、5kb、8kb、12kb PCR产物； B: 1~7 分别为以λDNA为模板扩增的 500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb PCR产物； C：1~8分别为以cDNA为模板扩增的166bp、552bp、960bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp、7600bp PCR产物。M:Marker 10000。

基因名称 模板使用量 gDNA：500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng 2kb~8kb 100ng ＞8kb 200ng λDNA：500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng Hela cDNA：166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相当mRNA 50ng ＞2kb 相当mRNA 200ng

≤2kb 2~8 kb ≥ 8 kb 95°C，2min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C， 2kb/min 32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C， 1kb/min 32cycles 72°C，2min 72°C，2min 72°C，2min

2.不同延伸速度对于扩增的影响

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix，以gDNA为模板扩增2259bp（A）和4564bp（B）目的片段，分别用不同的延伸时间，结果表明当目的片段长度≤2259 bp时G5 PCR Mix的延伸速度在4kb/min以上，而片段长度≥4564bp时延伸速度为2kb/min。A图1-4延伸时间分别为10s、30s、1min、2min，B图5-8同A图1-4；M: DNA Marker 10000。

3. 扩增灵敏度测试

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix，以gDNA为模板扩增2259bp目的片段，设置不同的模板梯度，结果表明基因模板低至1ng 时G5 PCR Mix也可以有效扩增。图中1-10模板量分别为0.5ng、1ng、5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng、0.5μg、1μg；M: DNA Marker 10000。

常见问题及解决方案：

无扩增或产量低 循环数 退火温度 模板DNA纯度和用量 延伸时间 引物用量 引物设计 增加循环数至35~40cycles 以2℃为单位降低退火温度 使用高纯度的模板DNA，使用合适的模板量。 延伸时间按1 kb/min设置 在0.1μM~0.5μM之间选取合适的引物量 重新设计优化引物 出现杂带或Smear 退火温度 引物浓度 循环数 模板DNA使用量 引物 以2℃为单位提高退火温度 降低引物浓度至0.2μM 降低循环数至25~28cycles 使用合适的模板量，不要过多使用 重新设计优化引物

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！