cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)-RNAi技术-试剂-生物在线
上海沪震实业有限公司
cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)

cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)

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产品名称: cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)

英文名称: NGS Library Quantification Kit for Illumina

产品编号: HZ0234

产品价格: 0

产品产地: 中国/上海

品牌商标: 沪震生物

更新时间: 2023-08-17T10:24:20

使用范围: null

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 cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)

中文名称:cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)
英文名称:NGS Library Quantification Kit for Illumina
产品规格:1ml|5ml
本产品是针对cfDNA的染料法(SYBR Green I)qPCR NGS文库定量试剂盒,提供了qPCR过程所需的反应混合液,DNA引物混合物、标准品以及样品稀释液,试剂体系完整,操作简单方便。反应混合物中所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合。本试剂盒使用的是一种经化学修饰的全新高效热启动聚合酶,酶的激活需在95℃下孵育10min。该产品特异性强、扩增效率高,试剂盒中的标准品长度(约270 bp)与cfDNA NGS文库的平均长度(250-300 bp)相当,能够对构建的cfDNA文库浓度进行快速准确的定量。

ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差,一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同,因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
·不需要ROX校正的仪器:Roche LightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-radiCyler iQ,iQ5,CFX96等。
·需要Low ROX校正的仪器:ABI Prism7500/7500 Fast,QuantStudio? 3 System,QuantStudio? 5 System,QuantStudio? 6 Flex System,QuantStudio? 7 Flex System,ViiA 7 system,Stratagene Mx3000/Mx3005P,Corbett Rotor Gene 3000等。
·需要High ROX校正的仪器:ABI Prism7000/7300/7700/7900,Eppendorf,ABI StepOne/Step One Plus等。

本产品是针对Illumina平台二代测序文库浓度绝对定量而设计。文库末端包含Illumina P5和P7芯片结合序列,长度不超过1 kb,浓度不低于0.02 pM即可使用本品进行定量实验。试剂盒提供的qPCR Primer Mix中包含如下两种引物序列:
Primer 1:5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3
Primer 2:5-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3
可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。

试剂盒组成:

组分 1mL 5mL
2×SYBR qPCR MasterMix 1ml 5×1ml
qPCR Primer Mix 100μl 500μl
DNA Standard A 100μl 500μl
DNA Standard B 100μl 500μl
DNA Standard C 100μl 500μl
DNA Standard D 100μl 500μl
DNA Standard E 100μl 500μl
50×High ROX 40μl 200μl


保存条件:-20℃,12个月,如需频繁使用,可存放于2-8℃,尽量避免反复冻融。

使用方法:

1.扩增模板准备
将待检测文库样品用TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)稀释,稀释后浓度尽量在0.01-60 pM之间。4℃冰上放置备用。

2.qPCR反应体系配制
配制前预先将所需的冷冻保存试剂完全融化并多次颠倒混匀,然后短暂离心后备用。20μl的基础反应体系如下:

成分 用量
2×SYBR qPCR MasterMix 10μl
qPCR Primer Mix 0.8μl
模板 4μl
ddH2O up to 20μl


说明:
High Rox机型:每50μl反应体系加入1μl High Rox;
Low Rox机型:每500μl反应体系加入1μl High Rox。
根据需要配出足够量的反应体系混合物,混匀后按每孔16μl体积加入至反应孔中,空白对照加入同样体积的TE,再将准备好的标准品和稀释的样品加入至对应反应孔中,加入量为4μl/孔。推荐使用20μl反应体系,如需进行更小体系反应,将体系各组分等比减少即可。

3.qPCR反应程序

步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 10min 1
变性 95℃ 10sec 40
退火/延伸 62℃ 30sec


1)如文库平均长度大于700 bp,应适量增加退火/延伸时间。
2)溶解曲线参照具体仪器设定程序。

数据分析:

1.标准曲线制作
照数据处理Excel表绘制标准曲线。标准曲线相关系数R2应不低于0.99,以Ct值为纵坐标时,斜率应位于-3.1与-3.6之间,如标准曲线参数不合理,建议重复实验。

成分 浓度
DNA Standard A 60pM
DNA Standard B 6pM
DNA Standard C 0.6pM
DNA Standard D 0.06pM
DNA Standard E 0.006pM



2.文库浓度计算
实验三个复孔间的Ct差异应不超过0.2,否则需删除无效数据或重复实验,请勿使用标准曲线有效Ct范围外的Ct计算稀释文库的浓度。

注意事项
1.在试验前,应详细阅读本说明。应由具备专业经验或经培训合格的人员进行操作。
2.使用请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。
3.避免反复冻融本品,反复冻融可能使产品性能下降。
4.配制反应液时,请使用新的或者无污染的枪头和离心管,尽量防止污染。 

特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!