T4 DNA连接酶

规 格：40000U,400U/μl
价 格：￥160
描 述：本产品是经原核表达，柱层析纯化等精制步骤获得的高纯度T4 DNA连接酶，适用于DN**段连接、PCR产物克隆等实验。

T4 DNA连接酶

T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。可连接双链DNA的平末端、互补粘性末端及其中的单链切口，也能催化RNA连接到DNA或者双链RNA上，但不催化单链核酸的连接。本产品是经原核表达，柱层析纯化等精制步骤获得的高纯度T4 DNA连接酶，分子量为55.2 kD。适用于DN**段连接、PCR产物克隆等实验。

来源
纯化自重组 E.coli 菌株，其中携带有编码T4 DNA连接酶的质粒

质量监测

核酸内切酶和核酸外切酶残留活性检测
将该制品分别与环状质粒DNA和线性DN**段于37℃保存24小时，DNA带型无变化，测试表明无内切脱氧核糖核酸酶和外切核糖核酸酶活性。
               
单位定义
T4 DNA连接酶在16℃反应温度下，在20 ml体系中反应20分钟，将经HindIII酶切的1 μg λ DNA的95%重新连接起来的酶量定义为0.01 Weiss单位。

保存条件
-20°C保存，缓冲液最好分装成小份（10次以内）-20°C保存。

注意事项
1. T4 DNA连接酶对热很敏感，容易因热失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存，避免频繁变换温度。
2. 连接反应缓冲液中含有ATP，使用前应在室温融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP加速降解。将缓冲液分装成小份储存于–20°C 以将ATP 和 DTT 的降解程度降到最低是一种推荐的保存方式；应避免将缓冲液长时间保存在4°C及以上温度。
3. 连接反应缓冲液中的 DTT 经冷冻后可能形成沉淀，可以将缓冲液震荡混合直到沉淀溶解。沉淀溶解后，不影响连接酶的性能。
4. 如果需要在连接反应后灭活T4 DNA连接酶，可将连接反应混合物置于65℃孵育10分钟或70℃加热5分钟即可使酶失活。
5. T4 DNA连接酶在较广的温度范围和连接时间条件下都能取得较好的连接效果，其最适反应温度是25°C。但因片段末端碱基组成不同，突出的碱基数目各异，退火所需要的温度也必然会有差异，因此，最适连接温度通常需要在T4 DNA连接酶的最适反应温度和保证片段充分退火之间求得平衡。短双链 (少于16个碱基的接头) 因自身融解温度（Tm）低需要的连接温度也较低。通常，低温连接需要较长的反应时间。平端连接一般在15–20°C 进行4–18 小时效果较好，而粘性末端在室温（22°C）反应 3 小时或 4–8°C 过夜反应较好。
6. 在连接反应中添加聚乙二醇（PEG）能促进连接反应，尤其是平末端的连接。但该促进效果受PEG质量的影响较大。
7. 反应体系中大于150 mM的NaCl可能抑制50%的连接活性，所以需要注意让盐浓度控制在合适范围内。0.2 M K+、Cs+、Li+、NH4+以及1 mM精胺都对连接酶的活性有不同程度的抑制，所以也需要引起重视。

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