pKD4载体选择主要考虑下述3点:
【1】构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型:
(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb选质粒。
(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。
(3)对原核表达载体应该注意3点:
①pKD4选择合适的启动子及相应的受体菌;
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。
pKD4选用质粒(最常用)做载体的4点要求:
①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;
④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。
pKD4无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。XY100806Earle溶液100mLXY91105Hanks溶液100mLXY100927D-Hanks溶液100mLXY100215PBS缓冲液(10×)250mLXY100807杜氏PBS溶液,10×100mLXY90306胰酶消化液250mL(A)|250mL(B)XY100301秋水仙素溶液1mLXY130819Bouin固定液2LXY131223Zenker固定液2LXY131224Helly固定液2LXY131225Carnoy固定液2LXY131200细胞计数液(Vi-CELL仪专用)100次XYpyj19细胞培养基1套XYygtz22荧光探针和示踪剂1瓶XYfly100细胞分离液1瓶XYydyz23细胞凋亡诱导剂和抑制剂1瓶XY100407人淋巴细胞分离液A型100mLXY90307青链霉素溶液100mLXY131134Percoll100mLXY131136Ficoll-Paque介质100mLXY100601细胞核微量制备试剂盒50次XY111207动物线粒体纯化试剂盒15次(A)|15次(B)XY111208植物线粒体纯化试剂盒15次(A)|15次(B)XY120308植物叶绿体纯化试剂盒15次XY100410超快转染试剂盒1mLXY130821阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒检测试剂100次|500次XY111105MTT检测试剂盒500次XY121205CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒5mLXY81026一站式生物素检测TUNEL试剂盒(DAB法)10次XY81025双染细胞凋亡检测试剂盒25次|50次XY130596荧光染色细胞凋亡检测试剂盒200次XY130862DAPI干粉10mgXY130863碘化丙啶干粉10mgXY130864Hoechst 33258干粉10mgXY130865Hoechst 33342干粉10mgXY130595双荧光素酶活性检测试剂盒100次XY130597萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒100次XY130598海肾荧光素酶活性检测试剂盒100次XY131012萤火虫荧光素1mLXY131019无内毒素萤火虫荧光素25mgXY130599β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒300次XY130802ADP/ATP发光法细胞活力检测试剂盒200次XY130801ATP发光法细胞活力检测试剂盒200次XY121104增强型天狼猩红染色试剂盒100mLXY121105茜素红S染色试剂盒100mLXY130822苏木素染色液15ml
细胞试剂盒