HiFi One-Step RT-PCR Mix

描述：本试剂采用稳定高效的 RT-PCR 预混体系，是以 RNA 为模板进行一步法 RT-PCR 的专用试剂。其原理为用基因特 异性引物进行反转录反应，获得第一链 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一链 cDNA），再使 用基因特异性正向引物和反向引物进行 PCR 扩增，在同一 反应体系中一步完成从反转录到 PCR 的全部过程。反应体 系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以 直接进行电泳。 在本试剂盒中，将耐热 M-MLV 反转录酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及稳定剂等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 预混液；反应 Buffer、dNTP 以及 电泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和 DNA 测 序。 主要优势：  耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂 二级结构，只需 10min 即可完成逆转录。  DNA 聚合酶为热启动型高保真酶，能够有效的抑制非 特异性反应且具有较高的校正活性，酶激活仅需 2min。  具有宽泛的模板量兼容性，10 ng~1μg 都可有效扩增。  反应过程中无需开盖，避免了操作过程中的污染危害。 组分 名称 250T 50×One-Step Enzyme Mix 100 μl 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml RNase Free H2O 1 ml×3 储存：请置于-20°C，可保存 2 年；避免反复冻融。 注意： 1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，第一次使用之前要离心 收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。 2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶，反应配制可在常 温进行，但各组分应-20°C 保存。 实验操作和反应条件： 1. 按以下组分配制反应液 RNA（病毒 DNA/RNA 样品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl 50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl 基因特异性上游引物（10μM） 0.8 μl 基因特异性下游引物（10μM） 0.8 μl Rnase Free H2O Up to 20 μl 注意：超过 1 μg 的 RNA 模板量会抑制 PCR 反应，建议第一 次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根据结果进行优化。 2. 在 PCR 仪上按以下条件进行 RT-PCR 反应: 55°C， 10min 逆转录反应 95°C， 2min 失活 M-MLV，并激活高保真聚合酶 95°C， 20s 30~40 cycles TM°C， 20s 72°C ， 2Kb/min 72°C， 2min 末端延伸 3. PCR 反应结束后，可取 5 μl 产物直接进行电泳检测。预混 液中已经包含绿色染料，无需再加入 DNA Loading Buffer。 1% Agarose 电泳时，蓝色指示剂指示 3~5 kb，黄色指示剂 指示 <50 bp。

本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系，是以RNA为模板进行一步法RT-PCR的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应，获得第一链cDNA（不可使用Oligo（dT）或Random Rimer合成第一链cDNA），再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增，在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以直接进行电泳。 在本试剂中，将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液；反应Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。

组分

组分名称 250T 50×One-Step Enzyme Mix 100 μl 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml RNase Free H2O 1 ml×3

注意：1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高，第一次使用之前要离心收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。 2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶，反应配制可在常温进行，但各组分应-20°C保存。

主要特征

 耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构，只需10min即可完成逆转录。 DNA聚合酶为热启动型高保真酶，能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性，酶激活仅需2min。 具有宽泛的模板量兼容性，10 ng~1μg都可有效扩增。 反应过程中无需开盖，避免了操作过程中的污染危害。

储存

请置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融。

实例

1.以Hela细胞总RNA为模板，使用HiFi One Step RT PCR Mix扩增不同长度的目的片段。电泳结果显示，166bp～4128bp 的 DNA 片段都得到了良好的扩增。

基因名称 模板使用量 gDNA：500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng 2kb~8kb 100ng ＞8kb 200ng λDNA：500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng Hela cDNA：166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相当mRNA 50ng ＞2kb 相当mRNA 200ng

>1000 bp 1000~3000 bp >3000 bp 55°C，10min 55°C，10min 55°C，10min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C，1min20s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C，2min 5s32cycles 72°C，2min 72°C，2min 72°C，2min

M：D10000 DNA Marker，1-7分别为：β-actin(166bp)、GAPDH (552bp)、GAPDH(960bp)、BMP2 (1574bp)、PRKN (1705bp)、TFRC (2755bp)和TFRC( 4128bp)。

2. 以Hela细胞总RNA为模板，使用不同的RNA模板量（1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg）进行HiFi One Step RT PCR Mix扩增。电泳结果显示，三种不同长度的片段都获得良好的扩增，过多的模板可能会抑制扩增。

960bp 1574bp 4128bp 55°C，10min 55°C，10min 55°C，10min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C，1min20s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C，2min 5s32cycles 72°C，2min 72°C，2min 72°C，2min

M：D10000 DNA Marker，1-9分别为1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg的 RNA模板扩增产物。

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