LAMP-TaqMan扩增试剂盒

描述：该制品系专为 RNA 样本的 LAMP 扩增反应设计， 制品中 Bst 4.0+ Polymerase 中包含 Bst 2.0 DNA 聚合 酶、 极其耐热 ThermoStable V 反 转录酶、Rnase Inhibitor，在 RNA 的 LAMP 扩增中无需再加入任何其它 酶制品即可用于 RNA 的 LAMP 扩增。除此外，Bst4.0+ DNA Polymerase 聚合酶中不含有甘油成分，因此可用于 建立 LAMP 引物 mix 与酶制品的冻干品，以提高 LAMP 检测制品的稳定性和易用性。 Bst 4.0+ Polymerase 可搭配不同的反应 Buffer 从而 实现不同的显色与检测方式。三种Buffer均已包含dNTP、 Mg 2+和相应的反应缓冲盐。其中 2xRed LAMP BufferD 用于红黄变色反应，扩增完毕后阳性样品为黄色，阴性样 品为红色；2xSG LAMP BufferD 包含 SYBR Green 染料 用于实时荧光检测；2xLAMP BufferD 用于浊度分析、浊 度仪或搭配 OG 橙绿变色反应管（阳性样本为绿色、阴性 样本为橙黄色，A3821）。 货 号 名 称 A3825 Bst4.0+ Polymerase (250 μl) A3825-01 2xRed LAMP BufferD (1 ml) A3825-02 2xLAMP BufferD (1 ml) A3825-03 2xSG LAMP BufferD (1 ml) 注意：Bst4.0+ Polymerase：2.5μl 该制品包含 8U Bst2.0 DNA Polymerase、20U ThermoStable V反转录酶、8U Rnase Inhibitor、22%海藻糖，不含甘油，可用于冻干。 储存：长期保存于-20℃，可保存 2 年。短期保存置于 4℃， 保存 3 个月，避免反复冻融。 使用方法： 1. 配制反应体系 在 0.2ml EP 反应管中加入下述试剂 2xLAMP BufferD 10 μl Bst4.0+ Polymerase 2.5 μl 10xLAMP Primer Mix 2 μl 模板 RNA X μl ddH2O 到总体积 20 μl 10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、 LoopF/B 分别为 4 μM、F3/B3 分别为 2 μM 2. 反应体系配好后，置于 60~68°C（首次实验采用 65°C） 进行反应 20~45min。 3. 引物及酶制品的冻干（可参考） Bst4.0+ DNA Polymerase 2.5 μl 10xLAMP Primer 2 µl 45%海藻糖 0.5 μl Total 5 μl 将该制品进行冻干处理，获得冻干品。 4. 冻干制品的 LAMP 扩增 向一份冻干品中加入 10 μl 的 2x Red LAMP BufferD 溶解冻 干制品，并加入最多 10 μl 的检测 RNA 模板(总体积为 20 μL) 进行 LAMP 扩增。 

LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的滚环扩增技术,在恒温条件下，呈指数级别放大核酸分子，30分钟内将DNA放大109~1010倍。其快速、恒温的独特技术优势，使得LAMP技术成为开发诊断试剂的明星潜力技术。由于在LAMP扩增中用到很高浓度的引物，因此难免保证有少量错配和引物Dimer，这些轻微的污染都会导致LAMP高速的扩增中造成假阳性检测。无论采用SYBR Green、浊度、HNB等各种显色方法都很难产生高特异性的信号。因此从公布至今有近20年的时间，其仍然无法在诊断试剂领域获得广泛应用。因此，将类似标准定量PCR中的TaqMan探针技术应用到LAMP检测中，一直是分子生物家追求的目标。至今，虽有多种探针设计方案，但均无法满足准确、可靠、快速的要求。 2019年，在开发非洲猪瘟快检试剂的实验过程中，由分子生物学工具酶领域的专家-张森博士领导的研发团队研发出了具有链置换活性和探针切割活性的DNA聚合酶-Bst 5.0，并将该酶成功用于LAMP和TaqMan探针组成的荧光检测系统上。应用该项技术后，在利用LAMP快速、高灵敏度、恒温检测优点的基础上，彻底解决了LAMP技术的假阳性问题。将TaqMan探针应用于LAMP扩增体系后，为LAMP技术更加广泛的应用于临床诊断奠定了坚实的基础。   主要特征 快速检测：可在15~25min内完成检测。 灵敏度高：可稳定的检测到单拷贝。 特异性高：六条特异性引物和一条TaqMan探针，保证了产物的特异性和检测的可靠性。 操作简单：恒温检测。 匹配便携式小型设备、可野外操作 适合粗样品的检测，无需核酸纯化制备。 LAMP TaqMan与TaqMan PCR的原理比较 LAMP TaqMan与TaqMan PCR的差异比较   TaqMan PCR法 LAMP TaqMan法 扩增条件 95-60℃循环变性、复性扩增 60℃恒温滚环扩增 引物靶标区域 3个特异性区域 9个特异性区域 信号放大级别 倍数级（增加2倍/循环） 指数级（增加107倍/min） 探针形式 双标记切割探针 双标记切割探针 报告基团 荧光基团，通常FAM 荧光基团，通常FAM 反应时间 35~60min 15~25min 是否可采用粗制核酸 全血或溶血样品必须提取核酸 所有样品可直接使用 所需的设备 标准定量PCR仪 可以使用标准定量PCR仪 也可以使用便携式恒温荧光仪 是否可野外操作 否 可以 敏感度 >50 Copy易判读 单Copy易判读 特异性 偶有假阳性 无假阳性 LAMP TaqMan与TaqMan PCR的敏感性和特异性比较 以非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）外膜蛋白P72为靶基因（GenBank No.:AY578706）为例, 分别应用LAMP-TaqMan和TaqMan qPCR法检测相同模板（标准质粒和病样），对其检测结果进行比较如下。 1、采用标准质粒进行灵敏度测试 结果显示TaqMan PCR法在100 copy以上是容易判读的，在10 copy以下并不容易判读；而LAMP TaqMan在5 copy的情况下仍然扩增有力，可以清晰判读。这得益于LAMP 107/min的复制能力，从扩增曲线可得知，在起峰后2~3min内，信号即可达到平台期，而且总体反应时间<20min，15min即可判读结果。 2、采用制备的病料DNA基因组进行灵敏度测试 将病料基因组DNA做梯度稀释进行测试，结果显示TaqMan PCR法在pg级（25~50 copy）以上是容易判读；而LAMP TaqMan在fg水平的情况下仍然可以清晰判读。从结果来看128fg的基因组DNA中含有单copy的病毒分子。 3、对低浓度模板的检测稳定性比较 结果显示TaqMan PCR法在5到10 copy的模板量条件下（8重复实验），判读较困难。而LAMP TaqMan在2 copy模板的条件下仍然清晰且稳定地判读（8重复实验）。 4、LAMP TaqMan在便携式恒温荧光检测仪上的表现 结果显示：在小型便携式恒温荧光检测仪上，LAMP TaqMan同样表现出色。其表现出来的敏感性、特异性、稳定性、结果的可靠性，远远超出任何其它恒温检测技术。 5、LAMP TaqMan对于低病毒含量粗制样品的检测较TaqMan qPCR效果更佳 结果显示：对于病毒含量极低的样品采用粗制品检测，LAMP-TaqMan方法检测的4个样品扩增有力，结果更加清晰可判，因此LAMP-TaqMan方法完全符合低病毒含量样本粗制品的检测要求。 LAMP TaqMan试剂形式 由于LAMP TaqMan引物和探针组合的设计工作仍然有相当的难度和不确定性，目前提供的仅为代开发和委托生产形式，销售和开发版权归属委托单位（但必须获得的技术授权）。在不久的将来，将推出设计软件，并将所有诊断试剂开发流程开放。目前提供的为冻干全试剂状态，冻干品包含Bst 5.0 DNA聚合酶、引物探针、dNTP和保护剂等，复溶后（为1x浓度）直接使用，提供50T/瓶和单支装两种形式。 （1）生产容易，批次稳定，保存、运输稳定，造价低。 （2）所有机器通用，根据设备需要用户自备反应管或板。 （3）复溶后试剂需要-20℃保存，且短期内用完。 （4）适合检测样品量较大的单位使用。 （1）生产难度大、次品率高、成本高、成品保质期低于瓶装试剂。 （2）目前仅提供透明0.2ml EP管，不适用于BioRad、Roche等定量PCR机型。 （3）使用方便，不受样品数限制。加入20µl溶解液后，再加入1µl模板即可上机反应。 （4）适合样品量较少、或练习等试验。适合恒温荧光检测仪，野外检测用。   特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！