一、简介

禽流感病毒实时荧光qRT-PCR检测试剂是按照美国农业部(USDA)的国际检测标准和我国《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.1-2004 )而制备的商业化检测试剂盒。本试剂盒为中的探针报告基团为6-FAM，淬灭基团为MGB。本方法可定性检测所有亚型禽流感病毒。

二、用途

本试剂盒适用于检测各种禽类喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液及细胞培养液等。可用于禽流感病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

三、试剂盒组成（48T/Kit）

四、储存条件及有效期

本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围

ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取

6.1 样品的采集

按照国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2003 )和《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.1-2004 )进行样品的采集。

6.2 样品RNA提取

可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。

（1） 取灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。

（2） 每管加入600 µL裂解液，分别加入被检样本200 µL，再加入200 µL氯仿，混匀器上振荡混匀5 s，于4℃ 12000 r 离心15 min。

（3） 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，加入-20℃预冷400µL异丙醇，吸取步骤（2）各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。

（4） 于4℃ 12000 r离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600µL 75％预冷乙醇，洗涤。

（5） 于4℃ 12000 r离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。

（6） 10000 r离心10 s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5 min～10 min。

（7） 加入10µL 无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000 r离心5 s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃ 冰箱。

注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液（AIV-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000r离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照（NTC）和阳性对照（AIV-PTC）5μL，10,000rpm瞬时离心10秒。

7.2 real time RT-PCR反应条件

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

在60°C 延伸时收集荧光信号 。报告基团：设置为FAM。

八、结果分析

8.1 结果分析条件设定

 直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

8.2 试验成立判定

（1） 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线。 

（2） 阳性对照（AIV -PTC）：均产生扩增曲线。

（3） 以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。

8.3 结果判定

（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明AIV核酸阳性。

（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明AIV核酸阴性。

（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。

（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行AIV qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数